本實驗室先前的研究顯示,大鼠腹腔巨噬細胞(RPM)在綠膿桿菌外毒素A(ETA)處理下會出現富含低生物活性的介白素1ㄐ]IL-1ㄐ^質內顆粒,此低活性的IL-1ㄔi藉內毒素(LPS)的刺激而轉具生物活性並分泌至細胞外。本實驗之目在進一步探討ETA對於RPM各種細胞素產生能力之影響以及IL-1ˋ嚝靬妡W積於細胞質內的可能機制。使用同步定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)以及酵素連結免疫吸附法(ELISA)分別分析RPM各種細胞素的mRNA以及蛋白質表現量,以及併用細胞骨架抑制藥物及LPS培養觀察其細胞骨架與細胞素產出的交互反應,並使用hemocolor stain及F-actin stain進行光學及共軛焦顯微鏡下形態及F-actin含量變化的觀察。結果顯示,RPM的IL-1ㄐBIL-1β、IL-6、TNF-ㄕb經ETA處理後mRNA表現量均有上升的情形,其中以IL-1ㄘMIL-6最為顯著,同時IL-1ㄘMIL-1β亦具有劑量與時間的效應。在培養上清液及細胞內容物中,可測得數種蛋白質產物包括IL-1ㄐBIL-1ra、IL-6、IL-18及TNF-ㄐA其中兩者同時存在有IL-1ㄐBTNF-ㄐA而IL-1β於兩者中均偵測不到。併用LPS刺激及actin抑制藥物cytochalasin、tubulin抑制藥物nocodazole探討細胞骨架在ETA促使RPM分泌IL-1ㄙ犒L程中所扮演的角色,結果顯示RPM經ETA處理後在細胞內容物及上清液中均有IL-1ㄙ漲s在,且其含量經LPS刺激之後於兩者中均呈明顯上升;反之,單獨ETA處理並不會促使RPM產生IL-1β,但LPS卻可使ETA處理過的RPM產生大量IL-1β。當ETA與nocodazole合併使用之後,即使用LPS刺激仍完全無IL-1ㄙ熔ㄔ矷A而ETA併用cytochalasin之後再以LPS刺激,雖在上清液中測不到有IL-1ㄐA但在細胞內容物中則仍可測得IL-1ㄙ熔ㄔ矷C在ETA處理的RPM,於攻毒24小時後光學顯微鏡下可見細胞質內出現嗜酸性顆粒,並隨攻毒時間延長而增加;利用共軛焦及螢光顯微鏡觀察F-actin的變化,在以10 ng/ml ETA攻毒9小時之後的RPM,偽足數量和大小及F-actin的含量均有明顯減少和減小的情形。綜合以上實驗結果可知,ETA雖可誘發RPM多種細胞素mRNA的表現,但並非均會有最終蛋白產物的產生,而IL-1ㄕbmRNA及蛋白質表現量上均受到激發,由於在ETA處理的RPM中F-actin的含量會明顯下降,而RPM在F-actin受抑制下即使有LPS刺激亦無法將製造出的IL-1
Our previous study showed that Pseudomonas aeruginosa exotoxin A(ETA)could induce the formation of low bioactivity IL-1
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