摘要 間葉幹細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 能透過血流跨越血管內皮屏障由骨髓遷移至受傷組織,並在受損部位分化成具功能的細胞,因此在再生醫學上扮演重要的角色。趨化素基質衍生因子 (Stroma-derived factor, SDF) -1α在幹細胞遷移至受損或缺氧組織亦具有加乘的效果。本研究目的在探討添加 SDF-1α (SDF) 以及4 J/cm2紅光 (Red) 與近紅外光 (NIR) 低能量光照刺激 (Low level light irradiation, LLLI) 提升大鼠骨髓 MSCs 遷移能力之機制。跨膜遷移試驗得知Red 和 NIR 組的移動細胞數高於控制組。而 SDF+Red 和 SDF+NIR 組與Red 和 NIR 組相比更能顯著提升細胞的遷移能力。此外,C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) 的基因和蛋白質表現以及焦點黏附激酶 (Focal adhesion kinase, FAK) 蛋白質磷酸化的表現也明顯提高。利用小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA)轉染大鼠骨髓 MSCs抑制FAK和 CXCR4表現,結果發現轉染 FAK siRNA 和CXCR4 siRNA分別可使細胞遷移降低 41 % 和58 %,無論是LLLI 或 SDF 處理仍無法使細胞遷移回復到與未轉染控制組相同的數目。其中,轉染 FAK siRNA 和CXCR4 siRNA分別可使 pFAK 表現分別降低36 % 和78 %;Red、NIR 和 SDF + Red、SDF + NIR 組的pFAK 表現全部被抑制。然而轉染 FAK siRNA 以及LLLI 或 SDF 處理對CXCR4的表現並無顯著影響。西方墨點法偵測發現 Red、NIR、SDF、SDF + Red 及SDF + NIR 組的phospho-Nuclear factor-κappa B (pNF-κB) p65表現皆明顯提升且會轉位至細胞核內,尤以SDF + NIR 組最為明顯。轉染 FAK siRNA後,無論是 LLLI 或 SDF 處理組的 pNF-κB p65表現均與控制組無差異;而轉染 CXCR4 siRNA 則會抑制所有組別之 pNF-κB p65表現。在基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloprotease, MMP)分析方面,明膠分解酶圖譜分析和即時定量聚合酶鏈鎖反應 (Quantitative real-time polymerase chain reaction, QPCR) 結果得知 Red、NIR、SDF、SDF + Red 及 SDF + NIR 組的 MMP-2 活性和基因表現量同樣明顯提高,SDF、SDF + Red 及 SDF + NIR 組的MMP-9 及MMP-14的表現皆高於控制組;而基質金屬蛋白酶組織抑制劑 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)-2 的基因表現則低於控制組。轉染FAK 和 CXCR4 siRNA 會使 MSCs的 MMP-2活性分別降低 23 及 25 %,而LLLI或SDF處理則會使其活性明顯降低,尤以SDF + NIR 組為甚。在 β1-integrin 及細胞骨架 F-actin表現影響方面,LLLI刺激及SDF誘導會提升β1-integrin 蛋白質的表現。CXCR4 siRNA 轉染 MSCs,會抑制各組之 β1-integrin 表現;轉染 FAK siRNA 則對各組之 β1-integrin表現無顯著影響。螢光染色發現Red、NIR、SDF、SDF + Red 及 SDF + NIR 組的細胞皮層有大量F-actin 聚集情形,亦偵測到其Rac/Cdc42及Rho 蛋白表現增加。在熱休克蛋白方面,QPCR 分析發現 SDF、SDF + Red 及 SDF + NIR 組的HSP27 基因表現分別降低37、25及22 %,Red、NIR、SDF、SDF + Red 及SDF + NIR 組的HSP90 基因表現分別降低62、58、58、71 及 79 %。綜上所述,紅光與近紅外光LLLI刺激和SDF-1α 處理能透過活化CXCR4、FAK及NF-κB的磷酸化、提升MMPs的分泌,進而使F-actin 聚合、增加Rac/Cdc42及Rho 蛋白表現,進而促進大鼠骨髓 MSCs 的遷移。
D型肝炎病毒為一含外套的病毒顆粒,外套蛋白質由B型肝炎病毒之表面抗原所組成。病毒顆粒內部則含有約1.7 kb的單股環狀RNA基因體與其所轉譯的delta抗原。delta抗原可分大型(214個胺基酸;27 kDa)與小型(195個胺基酸;24 kDa)兩者的差別僅在於大型delta抗原的羧端多了19個胺基酸。大小型抗原雖然在胺基酸組成及結構上有相當高的相似性,但兩者在病毒的生活史扮演著不同的角色。大型Delta抗原多出的19個胺基酸對於病毒顆粒的包裹是重要的。其具有促使大型delta抗原由細胞核輸送到細胞質中,與B型肝炎病毒之表面抗原共同組成病毒顆粒之功能。而小型delta抗原為病毒基因體複製所必須,大型delta抗原則抑制之。先前的研究即發現,大型delta抗原C端第198至210胺基酸為一細胞核輸出訊號(nuclear export signal; NES)而被命名為NES(HDAg-L)。本篇論文即針對病毒基因體探討細胞因子GAPDH與HDV基因體結合,對病毒複製的生物功能。另一方面則是針對與delta抗原核輸出訊號結合的細胞因子對病毒生活史的調控。 為了進一步了解GAPDH和HDV RNA間交互作用所扮演的可能功能,以能在哺乳動物細胞中,由SV40 promoter轉錄出HDV雙套體RNA並進行複製的質體pSVD2,轉染Huh7細胞。兩天後以間接免疫螢光染色,以觀察GAPDH在HDV RNA複製情況下,在細胞內分布的情形。在正常狀態下,GAPDH主要位於細胞質中。在轉染細胞中,則可以觀察到部分細胞核中觀測到GAPDH的存在。以間接免疫螢光染色及螢光原位雜交法同時觀察轉染細胞中,HDV RNA所在位置,發現其出現在細胞核質。將包含有GAPDH結合區域的HDV antigenomic RNA片段以活體外轉錄反應方式產生出來;隨著反應時間的增長,在GAPDH存在的狀況下確實使切割產物增加。結果也暗示GAPDH藉由與病毒RNA的結合,而在HDV RNA自我切割之核酸酶(ribozyme)活性扮演重要的角色。 利用酵母菌雙雜交系統我們找到一個會與輸出/包裹功能健全之delta抗原核輸出訊號〈NES(HDAg-L)〉但不與功能缺陷delta抗原核輸出訊號〈NES*(HDAg-L) 〉結合的細胞因子並將之命名為NESI (NES interacting)。NESI主要分佈于人類肝臟組織並包含467個胺基酸,含有一假設的actin結合區及bipartite核位訊息。以共同免疫沉澱及免疫螢光染色法則進一步確認大型delta抗原與NESI的特異性結合。在轉染細胞中過量表現反意(antisense) NESI RNA會抑制由大型delta抗原所媒介之HDV genomic RNA共同包裹於類病毒顆 粒。這些結果指出,藉由與大型delta抗原結合,NESI 發揮其在HDV的包裹扮演著關鍵性的角色。
蛋白質降解必須維持嚴密之調控,以確保細胞正常生理作用,在真核細胞中,蛋白質主要以被泛素標記的方式進行降解,稱為泛素蛋白酶體降解系統。E3連接酶複合體具有辨識特定蛋白受質並將之泛素化之功能,其中一群由Cullin蛋白家族為主體而組成。Cullin 4B為該家族成員之一,其基因在人類與小鼠都位於X染色體,而蛋白將成為CUL4B-RING-E3連接酶複合體之骨架結構。臨床報告指出,人類CUL4B基因突變後將導致性聯遺傳智能障礙與性腺功能低下等病徵,然而相關研究病例僅有外觀描述,對於病理分析與致病機制目前仍一無所悉,此外也欠缺Cul4b基因剔除小鼠疾病動物模式進行病理機制研究。為了探討Cul4b在生物體內所扮演的角色及參與之功能,本論文以條件式基因剔除策略建立了Cul4b基因標的小鼠,在將其第四與第五外顯子於早期胚胎特異性剔除後,成功得到Cul4b全身性基因剔除小鼠。第一部分結果:首先將小鼠進行動物行為學與神經學分析,發現Cul4b基因剔除小鼠呈現出與臨床病人類似的學習障礙行為與病徵,且海馬迴的神經元數量、樹突複雜性和棘密度與對照組相比均顯著性降低,證實Cul4b基因剔除小鼠可作為具有潛力的人類疾病動物模型。此外,本論文亦發現在小鼠所有器官中,睪丸具有最高濃度CUL4B表現量,同時也觀察到Cul4b基因剔除公鼠無法產生任何子代,顯示CUL4B可能參與精子生成作用。分析結果顯示,基因剔除公鼠副睪中所含有的成熟精子數量非常稀少,且碩果僅存的精子其結構呈現廣泛性頭部損傷,顯示大部分精子於精子生成過程中死亡,少部分精子雖存活但於精子形成過程中產生變異,最終導致雄性不孕症。雖然成鼠睪丸中精原幹細胞有絲分裂與精母細胞減數分裂過程均不受CUL4B缺失的影響,但減數分裂後的單倍體精細胞數量卻逐漸降低,同時伴隨著凋亡細胞的增加。由於單倍體精細胞最重要的機制為精子形成,經過頂體形成、染色質重組與核濃縮過程後,可將圓形精細胞轉變為延長形成熟精蟲,這些過程也是控制精細胞凋亡與頭部濃縮成形的關鍵作用。共軛焦與電子顯微鏡分析發現基因剔除鼠單倍體精細胞在頂體形成初期的高爾基氏期沒有受到影響,但是在頂體期即出現膨大或環繞的頂體結構與不規則核濃縮的缺陷精細胞。這些細胞依損傷程度不同,有些會死亡、萎縮而被賽氏細胞吸收,有些則順利釋出至副睪,但異常頭部結構仍然使這些精蟲無法與卵子接觸受精。分析出生後第一波精子生成過程,發現在出生後二十七天出現的圓形精細胞數量顯著降低,且凋亡細胞於此時期顯著增加。此外,超微結構觀察亦發現精細胞於頂體形成的頂體期產生死亡、萎縮或結構異常,此結果與成鼠的精子生成循環過程相符合,證實不論是Cul4b基因剔除成鼠或發育中仔鼠,精子生成主要於頂體形成的頂體期產生死亡或缺陷。進一步將正值第一波精子生成的睪丸組織進行蛋白質體分析,區分出野生型小鼠與基因剔除小鼠間的差異性蛋白質,再經由軟體分析,判斷差異性蛋白質所參與的分子機制或細胞功能,藉此尋找CUL4B專一性調控的受質蛋白,解開缺乏CUL4B後導致精子生成異常的調控機制。目前已知CUL4B主要影響到的訊息傳遞路徑為細胞骨架重整、細胞附著、細胞凋亡與存活、蛋白質降解與蛋白質折疊等,未來將經由蛋白質交互作用分析來驗證顯著變化的蛋白質是否為CUL4B之受質蛋白。本論文結果證實Cul4b基因剔除公鼠不孕的原因為單倍體精細胞形成過程中頂體形成與核濃縮產生缺陷,導致精子細胞大量死亡、精子頭部變形與頂體結構異常,最終精子數量減少、頭型結構異常、缺乏泳動力,使得基因剔除公鼠無法藉由正常精卵結合過程產生子代。第二部分結果:第一部分指出小鼠Cul4b基因突變後將導致學習障礙與雄性不孕症,但由於採用了E6.5胚胎特異性剔除方式,無法觀察到最早期胚胎發育與胎盤形成之影響。為研究Cul4b在小鼠體內早期胚胎發育與胎盤形成所扮演的角色及參與之功能,本論文第二部分以精卵基因剔除策略建立Cul4b基因缺乏小鼠,將其第四與第五外顯子敲除後,發現全身性Cul4b基因剔除胚胎將於胚胎期7.5天發育中止且死亡。至於Cul4b異合子基因剔除母鼠的表現型會因突變對偶基因來自父源或母源而有所差異。突變基因來自父源的Cul4b+/Δ小鼠可以正常生長及繁衍子代,外觀上和野生型小鼠無異。然而,突變基因來自母源的Cul4bΔ/+小鼠將於胚胎期11.5天後產生嚴重的發育遲緩現象,且大多於出生前死亡。根據X染色體失活的原理,在胚胎外組織內,來自父源的X染色體將優先被靜默化,使得Cul4bΔ/+小鼠的胎盤組織將完全沒有CUL4B表現。結果發現Cul4bΔ/+小鼠胎盤的滋養層巨細胞在胚胎期8.5天僅剩一半,海綿層滋養母細胞在胚胎期11.5天厚度嚴重不足,而迷宮層的血管組織從胚胎期11.5天開始呈現失序的結構。除此之外,由於迷宮層裡的物質交換空間被破壞,導致小鼠血管與母體血竇都顯著擴大,造成母體與胎兒血液氧氣與養分交換的表面積下降,胎兒因此營養不良導致死亡。若將胚胎期6.5天的小鼠於外胚層特異性剔除Cul4b,保留胎盤的CUL4B表現,此策略則可以使Cul4b基因剔除鼠與Cul4b異合子基因剔除鼠順利娩出。總結而言,我們的結果證明胚胎外組織的發育需要CUL4B參與,而我們也在第一部分提供了一個策略產生Cul4b基因剔除鼠,藉以模擬CUL4B突變患者,進行組織病理分析與分子機制探討。
蛋白質精胺酸甲基化為一重要的轉譯後修飾,調控細胞內多種生理反應,如:訊息傳遞、轉錄調節、RNA運輸與蛋白質之間的交互作用等。此修飾反應透過蛋白質精胺酸甲基轉移酶 (PRMT) 之作用,將甲基由甲基提供者S-adenosyl-L- methionine (SAM) 轉移至甲基接受蛋白的精胺酸上。實驗室以甲基接受蛋白常見區域GAR motif進行比對,找到當時仍未有研究之ㄧopen reading frame (accession number:AL080119) SERBP1 (SERPINE1 mRNA binding protein 1),此蛋白上帶有Arg-rich、RG-rich及RGG box區域,此三區域可能為精胺酸甲基轉移酶作用位置;而影響蛋白進入細胞核內的Nuclear localization signal (NLS) 區域則與RG-rich區域有重疊的情形。 首先針對SERBP1蛋白的精胺酸甲基化修飾來探討。由本研究結果發現,SERBP1會受到間接抑制甲基轉移酶藥物AdOx影響而造成蛋白的不對稱精胺酸甲基化程度降低,其中間RG-rich與C端RGG box區域為甲基化的接受區域。透過免疫沉澱發現,SERBP1會與甲基轉移酶PRMT1結合,其結合能力會受到蛋白上的甲基化程度而影響。在in vitro狀況下,重組蛋白SERBP1可受到PRMT1的甲基催化;利用siRNA減少細胞內PRMT1的表現量也可觀察到SERBP1的甲基化程度減少,代表SERBP1蛋白的確為PRMT1的受質蛋白。由免疫螢光染色觀察,內生性SERBP1蛋白主要表現在細胞質中。當細胞呈現低度甲基化時,SERBP1蛋白表現由原本在細胞質表現為主,而變成細胞核內增加或蛋白會平均分布於細胞內,且細胞核中有明顯顆粒狀結構形成;分析不同片段蛋白的表現情形,發現中間RG-rich區域會影響其在細胞核的表現,N端及C端區域可能與蛋白在細胞核輸出的過程有關。 進一步探討SERBP1與壓力顆粒之間的關係。由免疫沉澱實驗結果發現,在正常狀況下SERBP1會與部分已知的壓力顆粒相關蛋白 (如:FMRP、hnRNP A1等) 有結合關係,此結合是需要RNA的參與協助。觀察在壓力狀況下SERBP1於細胞內的表現位置,發現全長SERBP1蛋白會與壓力顆粒標的蛋白TIA-1共同存在於細胞質的壓力顆粒內;其他不同片段的SERBP1蛋白雖都會形成壓力顆粒,但其形成能力仍低於全長蛋白;也觀察到SERBP1蛋白在細胞核內的分布增加,且核仁有堆積的情形。比較不同甲基化程度的SERBP1與壓力顆粒形成之關係,發現當在移除壓力來源後,低度甲基化的SERBP1所形成的壓力顆粒其保留比例會較正常高,且細胞核內的分布也會因低度甲基化影響而造成保留比例增加。綜合以上實驗結果,可推論出SERBP1蛋白為精胺酸甲基轉移酶PRMT1的受質蛋白,此蛋白上的精胺酸甲基化程度,不僅會影響到在細胞內的表現情形,也影響在受到外界壓力刺激下其形成壓力顆粒的能力及在細胞核內堆積之情形。
細胞膜蛋白佔全部蛋白的30%,為蛋白質體學計畫中的研究重點。然而目前蛋白質相關的研究方法難以對細胞膜蛋白做非破壞的檢測,也無法長時間對單一樣本做連續變化的觀察。基於此,我們製作出以ITO為電極材料的生物晶片,非破壞性的連續測量細胞的交流阻抗。在本研究中MG-63細胞株培養於自製的ITO玻璃晶片上,當細胞成長數目越多時,電阻抗的變化量也越大,此與測量細胞活性之MTT法比較,有極高的線性相關(R2=0.9883,p<0.005)。本研究亦進一步結合免疫染色的原理,將帶有奈米級金粒子的抗體連結到細胞膜上Integrin β1蛋白,當有越多的Integrin膜蛋白存在時,細胞膜上被連結的金粒子也越多,此時會產生越大的電阻抗變化;與螢光染色法之讀值比較,亦有良好的線性相關(R2=0.9178,p<0.005)。本研究以較經濟的ITO晶片做為細胞膜蛋白非破壞性之研究方法,並為將來藥物篩選、癌細胞檢驗之應用性提供了初步的數據,但仍需要更多實驗佐證細胞膜蛋白量測相關之結果。
近十年來,各式不同的螢光材料開始發展,而人們也廣泛研究其在生命科學上的相關應用。螢光奈米鑽石是一種新穎的碳系奈米材料,一般由Ib類鑽石,利用高能量離子束轟擊產生空缺,再進行退火等處理,可以創造出大量的氮─空缺陷中心,此類缺陷中心在黃綠色光的激發下,可以發出紅色的螢光。相較於其他材料的優勢在於生物相容性高、螢光性質穩定、容易進行表面修飾,且不具有光漂白與光閃爍等缺點,適合進行生物的螢光標記或追蹤。 決定螢光奈米鑽石的螢光強度有許多因素,包含了製備方式、粒徑、氮雜質含量等等。藉由不同的螢光奈米鑽石其生命週期的測定,對於這一些因素影響螢光奈米鑽石螢光強度的原因可以有更深的了解。我們推測螢光奈米鑽石的螢光強度在高氮含量時並不隨之上升,是由於螢光生命週期的緣故;而不同製備方式、粒徑的螢光奈米鑽石,其螢光生命週期亦有一定差異且具規律。亦討論不同鑽石中氮─空缺陷中心的比率,進一步佐證文獻記載氮─空缺陷中心的生成機制。 小粒徑且螢光強度高的螢光奈米鑽石在生物標記上具有優勢。透過在螢光奈米鑽石上修飾蛋白質並修飾生物素的方式,可以讓螢光奈米鑽石透過生物素的專一親和性,標記細胞內的相關部位。我們採用細胞通道奈米管中的肌動蛋白作為標記的對象,可以得到不錯的專一性標記效果,同時也利用不同的粒徑進行實驗,得知將螢光奈米鑽石的粒徑縮小,則具有更明確共位性的標記結果是可期的。
成熟雌性哺乳動物其乳腺發育分為四個時期:處女期、懷孕期、泌乳期及離乳期。其中由腦垂腺所分泌之泌乳素 (prolactin, PRL) 於乳腺上皮細胞之生長、分化及泌乳扮演重要的角色。於泌乳時,泌乳素能透過結合於泌乳素接受體 (prolactin receptor, PRLR) 之酪胺酸激脢Jak-2磷酸化泌乳素接受體,然後泌乳素接受體磷酸化主要之訊號傳遞分子 (signal transducer and activator of transcription 5a, STAT5a),磷酸化之STAT5a會從細胞質轉移至細胞核,進而調控 b-酪蛋白啟動子之活性。此外,在Caveolin-1 (Cav-1) 的研究中亦發現,Cav-1剔除的小鼠其乳腺管及泡狀構造有提早成熟、提前泌乳與高度磷酸化STAT5a的現象,並且Cav-1認定為具有負調控Jak-2/STAT5a訊息傳遞之功能。另外在小鼠乳腺中,亦了解泌乳素能透過Ras-MAP Kinase訊息傳遞之路徑負調控Cav-1蛋白之表現。 經比對山羊與人類、山羊與小鼠之Cav-1啟動子序列,其相似度分別為74%、67%。亦比對山羊與人類、山羊與小鼠 b-酪蛋白基因轉錄起始點上游1683個核酸序列,其相似度分別為46%、49%。由於各物種間序列相似度上的差異,因此本研究之目的想探討山羊Cav-1於不朽化山羊乳腺上皮細胞 (caprine mammary epithelial cells, CMEC) 中之功能是否相似於人類及小鼠。 首先,透過puromycin的篩選,建立穩定表現人類泌乳素接受體 (human prolactin receptor, hPRLR) 之CMEC (CMEC/hPRLR)。為測定山羊 b-酪蛋白啟動子之活性,構築由山羊 b-酪蛋白啟動子 (-1683 - -1) 驅動表現螢火蟲冷光素之質體,並且為矯正轉型效率,亦構築由thymidine kinase (TK) 啟動子驅動表現珊瑚蟲冷光素之質體,並透過將上述二質體共同轉染入CMEC/hPRLR,再經泌乳素刺激,以建立由泌乳素誘導山羊 b-酪蛋白啟動子之系統。經由此系統,山羊 b-酪蛋白啟動子經泌乳素刺激後能提高36.1倍之活性。為了解泌乳素處理濃度對內源性山羊Cav-1表現之影響,以6種不同最終濃度 (濃度從0至15 ug/mL) 之泌乳素處理CMEC/hPRLR,並且在三個時間點 (處理後24、48及72小時) 抽取細胞總蛋白質,經西方吸漬法分析,內源性山羊Cav-1表現量於泌乳素處理後48及72小時,隨處理濃度之增加逐漸減少。接著為探討山羊Cav-1是否會減少泌乳素訊息傳遞誘導之STAT5a磷酸化,將山羊Cav-1質體與山羊STAT5a質體共同轉染入CMEC/hPRLR中,並以泌乳素刺激,經西方吸漬法分析,山羊STAT5a磷酸化程度明顯下降,此外轉染綠螢光蛋白 (EGFP) 之負控制組,並未影響山羊STAT5a的磷酸化。最後為探討山羊Cav-1是否透過降低山羊STAT5a磷酸化,進而降低山羊 b-酪蛋白啟動子之活性,因此於泌乳素誘導山羊 b-酪蛋白啟動子之系統中額外轉染山羊Cav-1,亦觀察到山羊 b-酪蛋白啟動子活性之降低。 由以上結果可知,CMEC/hPRLR經泌乳素之處理能減少內源性山羊Cav-1之表現,若外源性提高表現山羊Cav-1則會降低山羊STAT5a之磷酸化及降低山羊 b-酪蛋白啟動子之活性。因此,泌乳素處理CMEC/hPRLR時,其內源性山羊Cav-1表現降低及STAT5a磷酸化程度提高,對於促進不朽化山羊乳腺上皮細胞活化山羊 b-酪蛋白啟動子為重要之調控。
肺癌(lung cancer)是一個全球與台灣最常見的惡性疾病,台灣的肺癌死亡比率在四十年來增加近12倍。2009年台灣因肺癌而死亡的病患中,男性與女性皆居第一位,肺癌的盛行率在台灣迅速地增加,增長率大概是全世界最高,男性與女性的比率大致保持在2:1左右。肺癌的組織學型態可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌,非小細胞肺癌包括鱗狀上皮癌、腺癌、大細胞癌等。根據衛生署統計,台灣肺腺癌(lung adenocarcinoma)的數目與比例一直持續在增加中,已經超越鱗狀上皮癌,尤其在女性病患當中。台灣肺腺癌(lung adenocarcinoma)也與國外有所不同,根據國衛院研究發現,台灣肺腺癌病患有達55%具有表皮生長因子受體的基因突變,較國外高出許多,同時台灣肺腺癌病患接受化學治療或標靶治療的臨床反應,預期效果也比國外好。這顯示台灣的肺腺癌的致病機轉與疾病行為,可能與國外有明顯不同,進一步了解肺腺癌細胞的存活、增殖、凋亡、局部侵犯及遠端轉移的機轉,在臨床上就顯得相當重要,藉由這方面的研究,以期進而影響與改善肺腺癌病患的存活率。 細胞凋亡(apoptosis)是細胞死亡方法的一種,對於癌細胞的生長、分化、死亡扮演重要關鍵角色,癌細胞為了增加其存活率,適應生存環境,避免被身體免疫細胞殺死,發展出一套對抗細胞凋亡的方法,避免細胞死亡。在真核細胞生物中,粒線體(mitochondria)是細胞內供應能量及調控細胞生死的重要胞器,細胞凋亡發生時,粒線體藉由釋放凋亡誘導因子(apoptosis induced factor; AIF)與細胞色素C (cytochrome C; cyt C)進入細胞質與細胞核,分解細胞核內去氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid; DNA),使細胞走向凋亡一途。因此癌細胞發展出一套穩定粒線體的方法,在環境不良的情況下,預防細胞凋亡的產生,使癌細胞能存活下來。根據我們之前的研究與文獻回顧顯示,凋亡誘導因子蛋白在肺腺癌細胞凋亡中,扮演相當重要的關鍵角色。 腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATPase family, AAA domain containing 3A; ATAD3A)屬於AAA家族,具有腺嘌呤核苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase; ATP)活性,分布在內質網(endoplasmic reticulum; ER)與粒線體(mitochondria)膜狀部上,與促使粒線體分裂相關蛋白1 (dynamin-related protein 1; DRP1)、粒線體融合蛋白2 (mitofusin-2)、第一型視神經萎縮蛋白(optic atrophy type 1; OPA1)一起將凋亡誘導因子(AIF)從內質網,形成運輸小泡,再將凋亡誘導因子(AIF)運輸到粒線體中,這些蛋白與粒線體的分裂,融合與運輸有關,腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A同時可穩定粒線體,避免凋亡因誘導子與細胞色素C釋放到細胞質中,進而避免細胞凋亡。第一型視神經萎縮蛋白為Dynamin家族成員之一,是參與粒線體融合的重要蛋白;也與粒線體依賴的細胞凋亡機制有關。半胱氨酸蛋白酶14(caspase-14; casp-14)屬於半胱氨酸蛋白酶家族成員之ㄧ,分布在細胞質與細胞核中,並不在粒線體內,在蛋白質交互作用分析中顯示,半胱氨酸蛋白酶14會與凋亡誘導因子(AIF)產生交互作用,一但凋亡誘導因子(AIF)從粒線體中被釋放出來,半胱氨酸蛋白酶14會與凋亡誘導因子(AIF)結合,抑制凋亡誘導因子的(AIF)活性,進而避免細胞凋亡,使細胞存活下來。由以上現象,我們推測腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A),第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)都會影響凋亡誘導因子在粒線體與細胞質的活性與表現,腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)與第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)並在粒線體生理功能調控上也佔有重要的地位,這三種蛋白皆與肺腺癌細胞的凋亡,存在明顯相關。 本研究主要探討項目包括:腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A),第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)如何參與肺腺癌細胞的凋亡、其所在細胞內分布位置、與粒線體及凋亡誘導因子(AIF)的關係,如何磷酸化與作用、改變細胞內包器形態、運輸方式,影響細胞對化學治療藥物以及與肺腺癌病患臨床預後之間的相關。本研究以肺腺癌細胞株與肺腺癌病患手術後肺部組織檢體為材料,我們利用逆轉錄聚合酶連鎖反應方法偵測訊息核糖核酸(messenger RNA; mRNA)在肺腺癌細胞與組織檢體的表現,進一步利用蛋白表現系統,生產重組蛋白來製備抗體,再利用西方墨點法偵測蛋白在肺腺癌細胞株及病患檢體中的表現,以細胞免疫螢光染色與組織免疫染色觀察,腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)在細胞分布的主要位置為粒線體與內質網,第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)為粒線體,半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)在細胞分布的位置為細胞質與細胞核,並用電子顯微鏡觀察粒線體與內質網型態,與腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)表現量有關的變化,同時證明腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)表現量與病患臨床上的預後有明顯相關。再利用短干擾核糖核酸(small interfering RNA; siRNA)將腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A(ATAD3A)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)的表現降低,會影響肺腺癌細胞在順鉑(cisplatin)中的耐受度,進而推估與臨床化學治療的抗藥性有關,本實驗更證明腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)、第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)有磷酸化的情形,與其蛋白穩定度及功能有關。同時發現,腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)會與粒腺體相關蛋白粒線體分裂相關蛋白1(mitofusin-1),粒線體融合蛋白2(mitofusin-2)、第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)與產生交互作用。 綜合以上結果顯示,本研究證明腺嘌呤核苷三磷酸酶家族AAA區域包含3A蛋白(ATAD3A)、第一型視神經萎縮蛋白(OPA1)與半胱氨酸蛋白酶14(casp-14)為肺腺癌中新的抗凋亡因子,並與臨床預後有高度相關,希望經由此發現,進一步能影響肺腺癌的臨床判斷,改進治療效果,增進肺腺癌病患預後。
MicroRNA(miRNA)是一段長度約23個鹼基對的非編碼RNA分子,透過抑制基因轉譯,達到調節基因功能的目的。近年來,有許研究指出miRNA在腫瘤發展過程中,藉由調控細胞致癌基因和抑癌基因的表達,在癌症發展進程中扮演著極重要角色,本篇主旨在探討miR-139表現量的差異與乳癌預後之關聯。Chemokine receptor type 4 (CXCR4)為一細胞膜上之受體蛋白,被指出參與許多癌症的增生和侵襲轉移有密切關聯。本研究中,我們利用Targetsacn和microRNA.org網站上的生物資訊比對分析,預測CXCR4 基因可能為miR-139下游作用標的。接著,透過雙重冷光報導基因實驗(dual-luciferase reporter assay)和西方墨點法,證實miR-139會結合在CXCR4- 3'-UTR上,抑制CXCR4蛋白表現。進一步,持續表現(ecotopic expression) miR-139時,會抑制乳癌細胞的移動及侵襲能力。此外,於臨床檢體的分析中,我們針對66位乳癌患者的檢體以qPCR進行分析,相較於鄰近非腫瘤的乳房上皮細胞,miR-139在腫瘤細胞的表現量較低,且miR-139與乳癌惡化程度呈現負相關。
鐵鉑磁性奈米顆粒除了應用於磁性儲存媒體上以外,近年來更應用於生醫領域。鉑本身性質和金很接近,具有良好的生物相容性、無生物毒性、化學穩定性;而鐵為磁性優良的金屬,所以鐵鉑奈米合金是結合兩者優點。本研究是利用化學合成法去製備鐵鉑磁性奈米顆粒,並採用低毒性方式表面修飾2-氨基乙烷硫醇(SH),再利用簡單製程將葉酸拮抗劑 (Methotrexate,MTX) 接上,製備出具有磁性導引、癌症細胞標定以及磁致放熱之多功能奈米磁性顆粒。以化學合成法合出來的FePt為疏水性奈米粒子,由成份分析出來得知鐵與鉑比為58:42,在20000G的磁場下飽和磁化量為12.58 emu/g,在室溫下為超順磁。由細胞毒性測試可以得知濃度為400 μg/mL對老鼠纖維母細胞(L929)沒有明顯毒性。以2-氨基乙烷硫醇修飾FePt後,利用FT-IR得知於3400 cm-1有明顯OH官能基,表示成功修飾成親水性。之後將MTX接上奈米粒子上,由UV/VIS以及FT-IR證明成功接枝上MTX。將FePt-MTX做細胞毒性測試,發現濃度為0.075 mg/ml以下為安全使用劑量,最後將FePt於交流磁場下做藥物制放,MTX釋放量隨時間增長而增加,代表可以透過高週波之控制達到藥物制放的目的。
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