- 學位論文
天然抗菌胜肽 Cecropin B及其衍生物之功能與結構探討
Functional and Structural Studies of Natural Antimicrobial Peptide Cecropin B and its Derivatives
摘要
Cecropin B (CB)是一個從天蠶(Hyalophora cecropia) 血淋巴液分離出來的天然抗菌胜肽，由35個氨基酸組成，CB對於細菌具有廣泛的毒殺能力，但其對於人體紅血球細胞並不具有強烈的細胞溶破能力，圓二色光譜（circular dichroism, CD）的實驗結果顯示，CB在水溶液中為無序纏捲（random coil）的狀態，但是在極性溶劑中會轉換成alpha-螺旋，利用核磁共振光譜學的技術，研究CB在20% HFIP溶液中的立體結構，其由兩段alpha-螺旋（殘基 4-21 和 殘基25-34）所組成，中間由一個脯氨酸扭結(proline kink) (殘基22-24)連接。為了仔細分析研究CB，合成了截斷型的短胜肽CB-N27 (殘基 1-27) 和 CB-C17 (殘基 19-35)，並研究其脂膜的通透性、融合效應與抗菌活性，此兩種截斷型的胜肽都不具有抗菌作用，最小抑制濃度的抗菌測試實驗都顯示其損失了原有的抗菌能力，顯示適當的胜肽長度對於CB的抗菌能力是必須的。另一個CB衍生物CB1，是由CB將C端的部分，以N端序列取代所組成，CB1的多正電荷特性使其保留了抗菌能力，而CB 之N端序列的多正電荷(polycationic)與兩面性(amphipathic)的特性，有助於其抗菌活性，此外，CB-N27 和 CB-C17 的溶破脂膜特性、脂質混合能力、抗菌能力都下降，代表適當的長度的CB，不論是N端帶正電序列以及C端斥水性的部分，對於CB的功能來說都是重要的，而CB的螺旋-鉸鏈-螺旋(helix-hinge-helix)式的結構，讓CB兩段alpha-螺旋有可彎曲性，促進與脂膜的互動作用。 幾種天然的抗菌胜肽，包括 cecropins、magainins和melittins，都被發現具有殺死癌細胞的特性，然而這些胜肽的功效並不一定適合發展成對抗癌細胞的藥劑，我們的研究裡，利用天然抗菌胜肽CB當做模版，製造新穎的抗癌胜肽。cecropin 家族裡的一致序列模式為W-x(0,2)-[KDN]-x-{L}-K-[KRE]-[LI]-E-[RKN] (PROSITE資料庫編號：PS00268) ，而此特徵段序列就是對應在CB的N端，我們將此特徵序列重複三次，並在C端夾入一個鉸鏈(hinge)，成為一個新的胜肽命名為CB1a，CB1a 在水溶液中並無構形，但在類似脂膜的環境中可以形成alpha-螺旋，而CB1a 溶在有機極性溶劑的立體結構也以核磁共振光譜技術進行研究，CB1a在20% HFIP 溶液中，其結構為 螺旋-鉸鏈-螺旋 (helix – hinge - helix)的形式，而兩段螺旋片端中間的夾角約為 60~110度，在CB1a第一段螺旋結構的中間部位，有一個肝素結合位置 (heparin- binding motif)，恆溫熱卡計(isothermal titration calorimetry) 的實驗結果顯示， CB1a 在生理鹽度和25°C的環境下，與低分子量肝素的結合常數為1.66×105 M-1 ，CB1a 與肝素結合之後，造成很大的構形轉變，CB1a變的傾向於有二級結構的狀態。CB1a 對於幾株癌細胞展露出其具有發展前景的抗癌活性，但對於非癌細胞(non-cancer cells)的毒性卻是相對輕微，CB1a 對白血病與胃癌細胞的抑制濃度 IC50，大概低於CB的抑制濃度 2到8倍，此外，CB1a對於人類紅血球的溶血效應相當低，這些特性使得CB1a 可以被當作一個好的抗癌候選藥物。