- 學位論文
十字花科黑腐病菌中 ampR 和 bla 基因之轉錄調控
Transcriptional regulation of ampR and bla genes in Xanthomonas campestris pv. campestris
摘要
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) 是引起黑腐病菌主要病菌，它會 感染十字花科類的農作物，造成農作物收成非常大的損害，在先前的研究裡指 出，Xcc 可以產生beta-lactamase 水解 ampicillin (beta-lactam antibiotics)。 beta-lactamase 的表現已知是由 bla 基因產生 beta-lactamase，ampR 基因調控 bla 基因表現，另外還有 ampD 與 ampG 可能參與調控。ampR 基因位於 bla 基因上游，兩者 transcription 的方向相反，為了了解 Xcc 的 bla 基因和 ampR 基因與 beta-lactamase 活性表現的關聯性，Xc17ampR::Gm 和 Xc17bla::Gm 被 構築。利用最小抑菌濃度測試 (MIC) 以及 beta-lactamase 的活性測試，觀察抗 藥性的變化。另外構築 pFYPampR、pFYPampRF1、pFYPampRF2、pFYPbla、 pFYPblaF1 與 pFYPblaF2 (分別含有ampR 與 bla 啟動子的不同區域與 lacZ 基因形成 transcriptional fusion) 的質體分別送入 Xcc 的各菌株， 由 beta-galactosidase (report gene) 的活性表現測量突變株內 ampR 與 bla 啟動子 活性的改變。MIC 結果顯示在 ampR 與 bla 基因被破壞後，抗藥性明顯的下 降，表示 ampR 和 bla 基因在Xcc 的抗藥性裡扮演重要的腳色。在 ampR promoter 的活性部分：(1) 在野生株，無論有或無加 inducer，活性不變，顯示 ampR 基因表現不受 induer 所影響；(2) 在 Xc17ampR::Gm 突變株活性比野生 株高，顯示 AmpR 負調控 ampR 基因。在 bla promoter 的活性部分：(1) 含有 inducer 的環境下，活性上升，顯示 bla 基因的啟動可由 beta-lactam antibiotics 或 induer 激發；(2) 在 Xc17ampR::Gm 突變株活性降到剩背景值，顯示 bla 啟 動子啟動必須要有 ampR 基因的調控；(3) 在 Xc17bla::Gm 突變株活性比 Xc17 野生株來的高，顯示 Bla 自我負調控 bla 基因。在 ampRF1 promoter (缺 少 ampR 啟動子 -35 與 bla 啟動子 -10 的區域) 的活性部分：在野生株裡， ampRF1 與ampR promoter 活性相比，沒有太大的差異，顯示 AmpR 在缺少這 兩個區域表現不受影響。在 ampRF2 promoter (缺少 LysR motif 的區域) 的活性 部分：在野生株裡，ampRF2 與ampR promoter 活性相比，活性明顯降低約 3 倍，顯示 ampR 基因在缺少 LysR motif 的情況下表現大受影響。在 blaF1 promoter (缺少 LysR motif 的區域) 的活性部分：在野生株裡，blaF1 與bla promoter 活性相比，在第七小時有 inducer 的情況下，活性明顯降低約 40 倍， 顯示 Bla 在缺少 LysR motif 表現大受影響。在 blaF2 promoter (缺少 LysR motif、ampR 啟動子 -10 與 bla 啟動子 -35 的區域) 的活性部分：在野生株 裡，blaF2 與bla promoter 活性相比，在第七小時有 inducer 的情況下，活性明 顯降低約 40 倍，顯示 Bla 在缺少這三個區域表現大受影響。
並列摘要
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) is the causal agent of black rot disease of cruciferous plant. Previous studies demonstrated that the bla gene residing in the chromosome of Xcc encoding a beta-lactamase which hydrolyzes beta-lactam type antibiotics and renders Xcc antibiotic resistant. The ampR gene, adjacent to bla and oriented in the opposite direction, is essential for the expression of bla. To elucidate the mechanism of the regulation of the antibiotic esistance in Xcc, mutants of bla (Xc17bla::Gm) and ampR (Xc17ampR::Gm) were constructed by insertional mutagenesis. The antibiotic resistance was assayed by measuring the minimal inhibition concentration (MIC) in the presence of different antibiotics and the beta-lactamase activity. The promoter regions of bla and ampR were constructed into a promoter proving vector pFY13-9 to from a transcriptional fusion with a promoterless lacZ gene. The promoter activity was monitored by assaying the beta-galactosidase activity. Our data demonstrate that 1) The bla and ampR genes are essential for the beta-lactam type antibiotics resistance; 2) The expression of bla gene is inducible by beta-lactam type antibiotics and positively regulated by ampR in the transcriptional level; 3) Bla negatively regulates the expression of bla gene; 4) The LysR motif located upstream of bla promoter is essential for the induction of bla promoter by AmpR; 5) The ampR promoter expresses constitutively in the presence or absence of activator; 6) Expression of ampR gene is negatively regulated by AmpR; 7) LysR motif is essential for the expression of ampR gene.