Use of lac Fusion to Approach the High TyrB Production with a Runaway-Replication Vector

應用基因融合方法來達到以複製失調之質體大量生產TyrB蛋白質

趙雲鵬(Yun-Peng Chao) ； 賴建彰(Zhang Jian Lai) ； 羅翠娥(Tsuey-Er Lo)

《Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers》 31卷2期 (2000/03) Pp. 157-165

https://doi.org/10.6967/JCICE.200003.0157

摘要

在本研究中，我們發展一個簡單及有效的方法來決定最適生產條件，以複製失調的質體來達到大量製造TyrB蛋白質之目的。這個方法是將報導基因(lacZ)和tyrB基因啟動子融合在一起，並將這個融合基因片段選殖在複製失調的質體上，以期模擬tyrB基因在複製失調的質體上之實際表達情況。由於TyrB蛋白質的活性測量頗費時，因此藉由這個策略，我們可以避開TyrB蛋白質的活性測量，而只要測量LacZ酵素活性來反映tyrB基因在不同的環境變動下之表達情形，而這些環境因素包括溫度的效應、誘導基因表達的細胞生長階段、誘導溫度的變化速率和營養基質的改變等，結果我們由這些變動的環境中找尋到一最佳生產LacZ的條件。為了進一步確定這個條件可被用來生產相對最大量的TyrB蛋白質，我們將一完整的tyrB基因依同樣選殖上述融合基因之方式植入在複製失調的質體上，並測試TyrB蛋白質在選擇的數種條件下之產量，結果再度確立上述之最佳酵素生產條件可用來製造高於野生菌種135倍之TyrB酵素活性。由此結果可印證我們在此所發展的方法，確實可用來尋找TyrB蛋白質的最佳生產條件，而這也將有助於日後以大規模醱酵槽來量產TyrB蛋白質之工程目的。

並列摘要

An easy and efficient method was proposed to achieve high production of the tyrB gene product on a runaway-replication vector. The DNA containing the tyrB promoter fused transcriptionally with the lacZ gene was cloned into a runaway-replication plasmid, pRA90. With the aid of this gene fusion, the expression level of tyrB in response to temperature alter-ations, the induction cell density, the temperature upshift rate, and various culture medium was investigated by measuring LacZ activities. The optimal condition thus set up for LacZ production was adopted to yield TyrB by a similar clone harboring an intact tyrE gene. As a result, TyrB was over-amplified 135-fold in tenns of specific activity in comparison with the wild-type level. This work demonstrates the potential use of lacZ fusion to probe the sound condition for high TryB production with uncontrolled-replication plasmids.

並列關鍵字

L-phenylalanine ； Aminotransferase ； Gene Fusion ； β-Galactosidase