Endothelial Cell Cultures in the Study of Corneal Preservations

應用內皮細胞培養對角膜保存的研究

洪伯廷(Por-Tying Hung)

《中華民國眼科醫學會會刊》 5卷 (1966/05) Pp. 45-55

https://doi.org/10.30048/ACTASOS.196605.0007

摘要

在過去數年內，角膜移植的研究與實施，甚為普遍。從基礎生物學的探求到臨床上的應用，成為最引人注目的題目之一。由於手術儀器的改進，技術的進步，抗生素的出現和角膜生理的了解，部分表層角膜的移植，從19世紀以來的嘗試，總算克服了困難獲得成功。反過來看，部分全層的移植，以目前所採用的方法，所得結果仍然無法予測，開刀後時常由於角膜浮腫，溷濁，乃至結疤而失敗。
到現在為止，這種全層角膜移植的失敗，大家都認為是由於角膜內皮細胞活性的消失和角膜免疫反應為主要因素。由於需要活性的內皮細胞，所以這種全層移植，多用新鮮角膜，時間上也有種種的限制。也就是這原故，在表層角膜移植所用的一些忽略角膜活性的保存決，雖然有減低免疫反應的好處，卻不能應用在全層移植上。
在今天，用於全層移植的角膜，3日內者都保存在2℃到4℃的水箱內。使用甘油作保護劑，以冷凍保存生物細胞，早為人所熟知。至於使用血清保存角膜，早在1911，即由Magitot所報告。本篇報告就是以白色家兄的角膜作實驗，使用內皮細胞培養來判定其活性，對水蒸氣內4℃保存，冷凍保存，以及血清保存方法所作的檢討。
材料與方法
白色家兎經空氣注射斷氣後，無菌操作摘出兩眼，分為下述三組進行實驗：
（一）新鮮角膜與水箱保存；兎眼摘出後，即行內皮細胞的培養或經5小時到120小時4℃水蒸氣內的保存後，才作內皮細胞培養。
（二）冷凍保存；以緩慢冷凍法，保存在零下69℃，期間自3天，5天，9天，壹個月到貳個月。並分前房液置換與否。即以15%甘油於Hank's溶液或兎血清置換之。冷凍眼球取出後，快速解凍，經檢查角膜浮腫，透明度等後，作內皮細胞培養。
（三）血清浸漬保存：眼球摘出後，自角膜輸部3到4釐米處切除鞏膜，把角膜連帶部份鞏膜浸漬兎血清內，保存於4℃。期間自3天，5天到11天。然後取出作內皮細胞培養。
內皮細胞的培養係根據Stocker所報告方法，其主要步驟如下：
(1)內皮細胞連帶Descemet膜，從角膜實質小心剝離。
(2)把內皮細胞切成小片，放在小玻璃蓋片上，然後用雞血漿與雞胚胎抽出液固定。
(3)把玻璃小蓋片放入瓶內，加3cc的Eagle培養液，灑顯微鏡檢查內皮細胞後，送入36.5℃溫箱培養。
(4)每天檢查內皮細胞發育情形，並注意培養液的酸度。
結果
（一）新鮮角膜與水箱保存；外觀上新鮮角膜與水箱內3天的保存，並無甚大的區別。各組織片皆有良好的發育。唯在新鮮角膜，內皮細胞發育快，培養後約24到48小時，即有顯明的發育，而在冰箱內保存者，係存愈久，开始發育所需的時間也愈長。
（二）冷凍保存：保存9天以上者，細解凍後，角膜便有浮腫及溷濁出現。隨著保存時間的延長，內皮細胞的脫落也愈明顯。在保存二個月的一群，內皮細胞的脫落最為利害。作成組織片後剩下不到四分之一的細胞。在冰箱保存所見到的延遲發育，也很明顯。保存9天以上者，即看不到內皮細胞的發育。至於對冷凍過程的保護，則以15%甘油與血清，獲得最好的保護作用。
（三）國血清浸漬保存；用血清保存，5天內角膜的透明度與新鮮者無異。細胞完整，發育亦佳。保存到11天後，才有輕微的角膜浮腫和溷濁出現，
討論
（一）早在1911年，Magitot即曾報告有關角膜保存的研究。近年來，由於角膜供給的短少以及角膜的應用受到時間上種種的限制，對這方面的研究甚為普遍。
內皮細胞在維持正常角膜狀況甚為重要。角膜全層移植，也需要有活性的內皮細胞。現在可以決定內皮細胞活性的約有下述方法；即細胞酵素的組織化學染色，直接的角膜移植，以及內皮細胞培養。關於角膜細胞酵素，有人指出內皮細胞活性消失後，仍然有作用，所以不盡可靠。至於用角膜移植決定其活性，在臨床上，成功者固可謂活性沒有消失，但是失敗者，是否尚有其他因素，無法確定。
Matsui首先在1929年報告內皮細胞的培養。Slick最近報告用酵素消化，培養內皮細胞的方法。本實驗係採用Stocker所報告的組織片培養法。這方法可直接用顯微鏡觀察內皮細胞附著於Descemet膜的情形。角膜經保存後，作成組織片，內皮細胞附著Descemet膜的情形，由本實驗知道，與其活性有密切關係。內皮細胞脫落利害者，培養後，發育很差或沒有發育。當然，從這培養法，觀察到內皮細胞的發育，並不能立即斷定所有內皮細胞皆具活性，但是細胞活性與細胞發育有直接關係是無庸置疑的。
(二)冰箱水蒸氣內的保存，到120小時皆有內皮細胞的發育生長。保存時間愈久，其開始發育所須時間愈長。根據Mills對內皮細胞外傷後，細胞分裂的研究，應該在48小時內便有最旺盛的發育。因此，培養後48小時，尚未有發育生長者，即延遲生長者，或可暗示內皮細胞，已有某種程度的損傷。
（三）冷凍保存法在實驗室以及臨床上，已有不少的研究。在冷凍過程中，由妙滲透壓的改變，細胞組織會受到損傷而影響其活性。但是一方面，經過冷凍後，細胞組織之抗原減弱，可以避免一般移植開刀被，種種由於免疫反應所引起的併發症。
在本實驗，除用徐緩冷凍外，並以各種保護溶液置換前房水，必檢討內皮紅胞損傷情形。其中以15%甘油和兎血清做保護液，獲得最好的結果。內皮細胞經5天的冷凍保存，還可發育。據Mcpheroson的報告，也認為甘油最好。但是Miiller認為角膜表皮雖然使用甘油最佳，內皮細胞則以dimethyl sulfoxide最能保護冷凍損傷。此點尚待將來的闡明。
（四）自Magitot報告用血清保存角膜必來，最近對本法有不少再檢討的報告。在上述冷凍保存實驗中，眼球經前房液置換後，時常發生低眼壓，變得很柔軟，角膜也出現摺襞，所以本實驗採用角膜及部份鞏膜切除，放置試管內，在4℃保存。Stocker亦認為這種角膜切除此整個眼球的保存為佳。
這種血清保存的組織片，內皮細胞完整，且沒有脫落現象，其發育生長亦佳。用本法保存到5天，角膜外觀與新鮮角膜無異，保存到11天，才開始有輕度角膜浮腫及溷濁。
Maumenee在1951年指出移植的溷濁乃是一種免疫反應。桑原認為角膜實質細胞間隙的體液，為這種免疫反應抗原的主要來源。因此，把移植片浸漬於病人血清內，可使體液與血清置換，減低免疫反應。Stocker在人的全層角膜移植中，證明血清保存者比新鮮角膜為佳，而同意桑原的觀點。
由本實驗的結果，以及其他眾多的報告，血清浸漬法可保持內皮細胞活性似可確定，至於臨床的應用，仍須等待將來動物及人的實驗和檢討方可定論。
結論
為了將來在本省實施角膜移植，本報告使用兎子內皮細胞培養，觀察內皮細胞活性，對角膜長期保存法－冰箱4℃保存，零下69℃冷凍保存，以及血清浸漬保存－進行實驗，並提出檢討與討論。
(1)水蒸氣內4℃的保存到5天，在全例皆有內皮細胞的發育。唯其發育隨著保存時間延長，呈現遲延現象。溫箱培養後48小時，如尚無發育，可能暗示內皮細胞的損傷。
(2)冷凍保存法對內皮細胞活性有甚大影響。雖然15%甘油於血清，獲得最佳保護作用，但是內皮細胞的脫落與角膜溷濁，仍然是大問題。
(3)角膜與部份鞏膜切除後，放入血清在4℃保存到5天，角膜透明度與內皮細胞幾無影響。在全例皆可見到內皮細胞的發育。這種血清浸漬法，由本實驗結果來看，較適於角膜保存，將來這方面的人與動物的實驗，或可闡明角膜保存的問題。