- 學位論文
臺灣釀酒酵母菌臨床分離菌株之FLO11基因對其mat表現型及其他相關性狀探討 以釀酒酵母菌為模式生物建立研究人類ABCB4蛋白質功能分析之系統
Investigating the Roles of FLO11 on Mat Formation and Other Related Phenotypes in Taiwan Clinical Isolates of Saccharomyces cerevisiae Functional Analysis of Human ABCB4 Protein in Saccharomyces cerevisiae
摘要
中文摘要 — 第一部分 在微生物感染中生物膜之形成與微生物之致病力及抗藥性息息相關，菌體是否能黏附於物體表面則為生物膜形成之關鍵因素，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)為伺機性病原，擁有形成生物膜初始型態結構之能力，特稱為mat型態，Flo11p為形成mat之關鍵蛋白，若有Flo11基因缺失，將無法形成mat結構，此外Flo11p亦與S. cerevisiae塑膠表面黏附能力等相關，先前研究指出與Flo11p相關之性狀，會受到Flo11p表現量及FLO11基因串聯重覆序列之長度與排列影響其表現。 本實驗之研究目標為藉由分析台灣S. cerevisiae臨床分離菌株與實驗室菌株，比較其形成mat之能力、FL011基因型及相關型態，以探討臨床菌株之可能致病指標及影響mat生成之原因。分析11株台灣臨床分離菌株之mat表現型，發現其中一株YYC343擁有形成mat之傾向，而塑膠表面黏附能力為菌株形成生物膜之第一步，以11株臨床分離株進行研究結果顯示其中7株其黏附於塑膠表面之能力較實驗室菌株YYC377 (S288c)高，其中包含具形成mat傾向之YYC343；此外一般認為菌體表面疏水性於塑膠表面黏附能力扮演重要角色，而實驗結果顯示11株臨床分離株皆擁有較高之細胞表面疏水性。而分析114株YYC343 segregants之mat表現型，發現其中61株四分孢子無mat表現型、17株有典型mat表現型、36株為非典型mat表現型，因此YYC343 segregants提供了良好材料以進一步分析mat表現型與FL011基因型之關係，因而分別從中挑選6株無mat表現型及6株具典型mat表現型之segregants進行FLO11基因串聯重覆序列PCR，發現6株具典型mat表現型，其FLO11基因串聯重覆序列大小比另6株無mat表現型者短約1 kb，且其中央串聯重覆序列排列組合方式亦不相同，而以12株YYC343 segregants進行研究顯示細胞表面疏水性、塑膠表面黏附能力與mat表現型為正相關，具mat表現型之菌株亦擁有較高之細胞表面疏水性及塑膠表面黏附能力，此外12株YYC343 segregants中具有形成假菌絲生長能力之菌株亦具有mat表現型，顯示影響假菌絲生長之FLO11基因亦會同時影響mat表現型之生成，然而於抗黴菌藥物感受性試驗中顯示，不論具有mat表現型之菌株或已形成mat結構之菌體皆不影響其藥物感受性，因此S. cerevisia菌株之mat表現型與其抗黴菌藥物感受性無關。本實驗結果顯示台灣臨床S. cerevisia菌株多具有塑膠表面黏附能力及高細胞表面疏水性，此外細胞表面疏水性、塑膠表面黏附能力與mat表現型為正相關。 關鍵字：生物膜/FLO11/釀酒酵母菌/九十六孔微量培養盤黏附性/菌株細胞表面疏水性/抗黴菌藥物感受性試驗/假菌絲生長 中文摘要 — 第二部分 進行性家族性肝內膽汁滯留症 (progressive familial intrahepatic cholestasis，簡稱PFIC)，為一群由基因缺陷而導致肝細胞膽汁排泄功能異常之遺傳疾病，好發於嬰幼兒時期之罕見疾病，發生原因為基因缺陷使得肝細胞無法正常運送膽汁成分至細胞外，使得膽汁滯留而引起黃疸等相關臨床症狀，亦可能在一、二十歲時引起肝硬化、肝衰竭，而需進行肝移植手術。 進行性家族性肝內膽汁滯留症分為三型，分別由ATP8B1、ABCB11、ABCB4三種不同基因缺陷所引起，其中第三型進行性家族性肝內膽汁滯留症 (PFIC3) 即為ABCB4 (ATP-binding cassette sub-family B member 4)基因缺陷所造成，ABCB4蛋白主要表現在肝細胞小管膜 (canalicular membrane) 上，為一種phosphatidylcholine floppase，負責將phosphatidylcholine從細胞膜雙層膜之內層膜運送至外層膜上， phosphatidylcholine在膽汁中主要功能為降低膽汁酸中的疏水性特性，保護細胞不受膽汁酸之傷害，若膽汁中無phosphatidylcholine存在，將使膽管細胞受到傷害而進一步引起相關病症。 台大醫院小兒科陳慧玲醫師團隊，於五位PFIC3病患身上發現不同之ABCB4基因突變，包含三種基因缺失突變及一個點突變造成停止碼 (stop codon) 提早出現之基因突變，然而這些ABCB4基因突變與PFIC3疾病之關係，仍未經實驗證實。 本研究使用S. cerevisiae之sec6-4突變株做為生物模式，建立系統表現人類ABCB4蛋白，以便未來進行後續功能分析試驗，進一步分析台灣病患其ABCB4基因突變與PFIC3疾病之關係，選用酵母菌之原因為其擁有培養容易、生長快速、便宜、易操作、大量表現蛋白等優點，而sec6-4突變株其有胞吐作用之缺陷，使其於37℃環境下，在細胞質中含有大量分泌囊胞 (secretory vesicles) 累積，以方便獲得大量含有成熟蛋白質之分泌囊胞，以利未來進行後續功能試驗，為使S. cerevisiae表現人類ABCB4蛋白，本實驗將帶有ABCB4基因之pRS416系列質體送入S. cerevisiae，並以西方墨點法及聚丙烯醯胺膠電泳法確認ABCB4蛋白之表現，卻未如預期偵測到ABCB4蛋白之表現，然而以反轉錄聚合酶連鎖反應證實具有ABCB4 mRNA之表現，另一方面本實驗可自S. cerevisiae之sec6-4突變株成功分離出分泌囊胞，總結來說，本研究將帶有ABCB4基因之pRS416系列質體送入S. cerevisiae，且具有mRNA之表現，然而無法偵測到ABCB4蛋白質之表現，若未來能於S. cerevisiae順利表現ABCB4蛋白，則可利用本實驗之方法，純化出分泌囊胞以進行ABCB4蛋白質功能分析。
參考文獻
延伸閱讀
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