肝素及其結合蛋白對斑馬魚
胚胎發育之研究

中文摘要肝素(Heparin)藉著與肝素結合蛋白 (HBP；Heparin-binding protein) 結合，而在生物體發育及生長中扮演調節角色。但它對於胚胎發育之影響為何？值得加以探討。首先，本研究利用顯微注射法 (microinjection) 將肝素注入１個細胞期斑馬魚(Danio rerio)胚胎之細胞內，觀察其表現型 (phenotype) 及造血相關基因之影響，進而探討肝素結合蛋白之mRNA與肝素共同注射後對胚胎發育之影響。結果顯示，注射肝素48小時後，呈現表現型之胚體較小、心臟區膨大而無血或全身缺乏血液循環。基因型之影響方面，肝素引起之部份突變者，其spt、ikaros、hhex和e1b等4種與造血有關基因轉錄物確有減少或甚至消失之現象。當進一步以plei 1、plei 2和FGFBP等肝素結合蛋白之mRNA進行共同注射後，發現其mRNA確實有減緩因肝素所引起之作用。以plei 1、plei 2和FGFBP之Morpholino注射後發現，因為阻斷mRNA之轉譯作用，出現與肝素注射者相同之突變表現型。總之，肝素確實透過HBP進行生物活性調控作用。本研究選殖斑馬魚HBNF (Heparin-binding neurotrophic factor) cDNA，並且以生物資訊系統分析基因體結構。結果發現，斑馬魚HBNF基因含5個外顯子和4個內引子，分佈在幾近82kb片段中。RT-PCR分析結果顯示，斑馬魚HBNF轉錄物高度表現於成熟的腦部和腸道，但是其它組織則表現量很少。胚胎發育過程而言，於發育早期階段，斑馬魚HBNF轉錄物呈現中等程度表現量，但之後則是表現量逐漸減少；在孵化後呈現高度表現量直至成熟階段。HBNF全部胺基酸序列與人類HBNF有60%相同性，但與其他midkine幾乎只有40%相同性。與其他哺乳動物者相似，斑馬魚HBNF不需NGF刺激下，促進對PC12細胞神經外生作用 (neurite outgrowth)。除此之外，斑馬魚HBNF也在斑馬魚胚胎發育中，具有加強全身神經之神經外生作用。總之，本研究建立以斑馬魚進行活體內神經外生作用之分析系統。　　Hip/L29是一種能與heparin/heparan sulfate結合，並且與核醣體蛋白L29相似之蛋白質。本研究選殖圓斑河魨Hip基因，並研究此基因啟動子區域之特性。圓斑河魨Hip (TfL29)基因組成含有4個外顯子(Exons)和3個內隱子(Introns)，分佈在1.7kb片段中，並且第一內隱子存在於5’端非轉錄區，而第一顯子上游2.2kb序列含10個E-boxes和釵h轉錄因子結合位，如GATA-1、AML-1a、Oct-1、CdxA及NRF-2等。全長的圓斑河魨Hip cDNA能轉譯出由68個胺基酸的蛋白質。比人類Hip基因蛋白質少91個胺基酸。圓斑河魨Hip蛋白質與鯰魚、斑馬魚、線蟲及果蠅相同度分別為75%、75%、49%及45%。而位於圓斑河魨Hip蛋白質之43~58胺基酸有一確知的heparin/heparan sulfate結合區MRFAKKHNKKGLKKMQ。圓斑河魨Hip mRNA的普遍存在所有成熟組織中。我們所選殖圓斑河魨Hip基因的啟動子序列2.6 kb，分析轉錄起始點上游300bp區域，不含典型TATA或CCAAT box。長短不同之啟動子片段，分別以COS-1細胞、斑馬魚且配合Luciferase及GFP為報導基因進行分析。結果顯示，所有片段於活體內及離體(試管)內皆有轉錄活性。而不含Intron I者比含Intron I者，其啟動子活性較強。除0.3kb除外，片段愈長於體內及試管內轉錄活性較強。

關鍵字

核醣體蛋白L29 ；肝素神經刺激因子；肝素；圓斑河魨；斑馬魚；肝素結合蛋白

並列摘要

英文摘要 Heparin is a negatively charged and sulfated glycosaminoglycan. In order to form the proteoglycan, by using the covalently bond, heparin could bind to the serine of core protein. Heparin was also play an important role in the growth and development of many organisms. This experiment was done by micro-injected the exogenous heparin into the fertilzated egg of zebrafish (Danio rerio) at one cell stage. After cultured at 28

並列關鍵字

HBNF ； Zebrafish(Danio rerio) ； heparin ； Pufferfish ； HBP

參考文獻

2. Ahmad Z, Lee FT, Dopaoli-Roach AA, Roach PJ. 1986. Heparin-activated protein kinase from rabbit muscle: relationship to enzymes of the glycogen synthase kinase-3 category. Arch Biochem Biophys 250: 329-335.

4. Aiken M, Ciaglowski RE, Walz DA. 1986. Isolation and identification of a 23,000 -Dalton heparin-binding fragment form the amino terminus of bovine thrombospondin. Arch Biochem Biophys 250: 257-262.

5. Akhter S, Ichihara-Tanaka K, Kojima S, Muramatus H, Inui T, Kimura T, Kaneda N, Talukder AH, Kadomatsu K, Inagaki F, Muramatsu T. 1998. Clusters of basic amino acids in midkine: Roles in neurite-promoting activity and plasminogen activator-enchancing activity. J Biochem (Tokyo) 123: 1127-1136.

6. Alam J, Cook JL. 1990. Reporter gene: Application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem 188:245-154.

7. Amacher SL, Buskin JN, Hauschka SD. 1993. Multiple regulatory elements contribute differentially to muscle creatine kinase enhancer activity in skeletal and cardiac muscle. Mol Cell Biol 13: 2753-2764.

國際替代計量

肝素及其結合蛋白對斑馬魚胚胎發育之研究

全文下載

主題瀏覽