血管新生因子在急性骨髓性白血病之研究

Expression of angiopoietins and vascular endothelial growth factors on bone marrow mononuclear cells from acute myeloid leukemia patients and their clinical significance

侯信安(Hsin-an Hou)

指導教授 ： 田蕙芬

國立臺灣大學/醫學院/臨床醫學研究所/碩士(2007年)

https://doi.org/10.6342/NTU.2007.01313

摘要

急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia, AML) 是一種骨髓細胞功能異常且癌症變化的疾病。因此骨髓中缺乏正常的幹細胞，故無法製造足夠的正常血球，因此病患往往死於貧血、出血或感染的問題。很多的科學研究指出：血管新生(angiogenesis) 在固態腫瘤 (solid tumor)之形成、擴散及轉移中扮演舉足輕重的角色。近來的研究報告也顯示：在血液的惡性腫瘤疾病裡，血管新生對於其致病機轉也有其重要地位。一般認為是血癌細胞及其附近之間質細胞 (stromal cell) 分泌許多促使血管新生的物質(angiogenic substances)，其會分布在microenvironment中，而這些物質會活化血管內皮細胞 (endothelial cells)以產生血管新生，進而加速腫瘤之生長。
因此為了了解急性骨髓性白血病其血管新生現象與其腫瘤間之關聯、臨床症狀及表徵與存活分析，故藉者收集急性白血病病患骨髓 (bone marrow ,BM) 之檢体，利用即時定量聚合酶連鎖反應合成法(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)、免疫細胞化學染色法(immunocytochemical stain, ICS) 及酵素免疫吸附檢測方法 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 的方法，希望能找到AML與血管新生 (angiogenesis) 間之關係。
我們從民國八十四年至九十五年間台大醫院血液科診斷為急性骨髓性白血病且接受標準化學治療之病患共計126位，利用即時定量聚合酶連鎖反應合成(RQ-PCR)的方法分析骨髓芽細胞中血管新生因子訊息核醣核酸 (mRNA) 的含量，包括研究 Angiopoietin 1 (Ang-1)、Angiopoietin 2 (Ang-2)、Tie2 receptor、Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) 與 VEGF-C 五種血管新生因子。此外針對 Ang-2的表現，我們額外作有關芽細胞之免疫細胞化學染色法及血漿蛋白之酵素免疫吸附檢測方法分析。至於臨床上分析的指標包含性別、年齡、FAB 分類、白血球數目、芽細胞總量、血色素、血小板數目、LDH數值、染色體變化、及治療上之效果 (含括血管新生因子數值高低與存活率(overall survival)、緩解率 (complete remission)、復發率(relapse rate)、無復發狀況之存活率(relapse-free survival)之相關性)。
我們的結果發現：急性骨髓性白血病之病人在Ang-1、Ang-2與VEGF-A之表現上都高於正常對照組 (Ang-1： P<0.0001; Ang-2： P=0.009; VEGF-A：P<0.0001)。而 VEGF-C 的表現則低於正常對照組上(P=0.011)，至於 Tie2 的表現則在兩組間無統計學差異(P=0.9142)。此外，利用免疫細胞化學染色法 (immunocytochemical staining) 分析九位病患白血病芽細胞之Ang-2 蛋白表現，發現Ang-2蛋白的表現與利用即時定量聚合酶連鎖反應合成法 (RQ-PCR)所測量之訊息核醣核酸 (mRNA)表現呈現一致。換言之，Ang-2 蛋白表現在較高之訊息核醣核酸之病患中，芽細胞的染色呈現高訊號及強度；相反地在較低之訊息核醣核酸之病患中，芽細胞的染色呈現低訊號及強度。同時在所有三十一位擁有骨髓血清之病患中，我們發現利用酵素免疫吸附檢測方法 (ELISA)而得到之Ang-2蛋白量，它們的數值與訊息核醣核酸 (mRNA)之表現量具有高度一致性 (P=0.022 by Spearman’s rank)。
在臨床表徵方面：我們發現Ang-1 與 Ang-2 的表現與絕對周邊芽細胞之總數 (absolute peripheral blast counts) 呈現正相關 (分別為P= 0.0044 及 0.0041)，而VEGF-A 與 VEGF-C 的表現與絕對周邊芽細胞之總數 (absolute peripheral blast counts) 呈現負相關 (分別為P= 0.011 及 0.019)。其他包括性別、年齡、白血球數目、血色素、血小板數目、LDH數值、染色體變化及FAB classification 皆與五種新生血管因子之數值沒有特別的關係。
在病患之預後方面：利用單一變數分析法發現：不好之染色體 (unfavorable karyotype)、較高之Ang-2 的族群、較高之Ang-1 的族群及較高之Tie2 的族群擁有較差的無復發狀況之存活率 (relapse-free survival)。至於性別、年齡、白血球數目、血色素、血小板數目、LDH數值及VEGF-A & VEGF-C 的高低與無復發狀況之存活率之長短無關。至於在 存活率 (overall survival) 方面，年紀超過40歲、不好之染色體 (unfavorable karyotype)、較高之Ang-1 的族群及較高之Tie2 的族群擁有較差的存活率。
至於使用Cox proportional hazards 之多變項分析可以發現，在無復發狀況之存活率方面：唯一的獨立變項因子，即是擁有不好之染色體 (unfavorable karyotype)，其 hazard ratio 為3.1 (95% CI 1.78-5.40, P<0.0001)。其他血管新生因子的表現皆非獨立因子。在存活率方面：除了擁有不好之染色體 (unfavorable karyotype)，其 hazard ratio 為2.19 (95% CI 1.78-5.40, P<0.0001)外，較高之Ang-2 的族群亦是較差之獨立因子，其 hazard ratio 為2.05 (95% CI 1.20-3.52, P=0.009)。
利用Kaplan-Meier curves存活分析，可以顯示Ang-2 的表現高低與存活時間有明顯相關。換言之；有較高Ang-2 表現的病患平均存活時間為 38±16.8 個月，較低Ang-2 表現的病患平均存活時間為 15.7±3.27 個月 (P=0.005)。而在同時擁有血清檢體的病患中，若是其蛋白質分泌表現大於 3 ng/ml之病患比那些蛋白質分泌表現小於 3 ng/ml之病患有較差之存活時間，統計上有明顯之差距。(平均存活時間, 5±1.47 versus 13±5.24 months, P=0.018)。此外，在那些擁有一般染色體變化之病患中，Ang-2 的表現對於病患之存活率有更大之影響 (P=0.004)。換言之，在這群族群中，有較高Ang-2 表現的病患平均存活時間為 55±20.57 個月，而較低Ang-2 表現的病患平均存活時間只有 16±2.92 個月。
由於血管新生因子會彼此交互影響，我們同時做次族群之分析 (subgroup analysis)。我們發現Ang-2 的表現高低在較低之Ang-1與Tie2的族群中其存活時間之差距特別明顯相關(P=0.003 及 P=0.003)，而在較高之Ang-1與Tie2的族群中其存活時間之差距並無明顯相關。另外方面，Ang-2 的表現高低在較高之VEGF-A與VEGF-C的族群中其存活時間之差距特別明顯相關(P=0.038 及 P=0.05)，而在較低之VEGF-A與VEGF-C的族群中其存活時間之差距則無明顯相關。
我們的實驗是第一篇研究急性骨髓性白血病病患之骨髓中血管新生因子的表現。病患中血管新生因子的表現與正常骨髓有明顯之差異。此外，不論是訊息核醣核酸或是蛋白質的測量，Ang-2 的表現更是與病患預後有顯著相關，這樣的相連性在擁有一般染色體變化之病患中更為清楚。此外，我們的研究也發現血管新生因子間的合作，亦會影響病患的臨床表現與預後。因此，Ang-2 的表現可能可以視為急性骨髓性白血病病患的一個生物指標，可望當作病患疾病評估、追蹤與治療的參考。

關鍵字

急性白血病 ； 血管新生因子 ； 臨床預後

並列摘要

BACKGROUD. Concerted expression of angiopoietins, their receptor Tie2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) family plays an essential role in normal and pathologic angiogenesis, but its clinical implication in AML remained unclear. .
METHODS. We investigated the RNA expression of genes encoding angiopoietin-1 (Ang-1), angiopoietin-2 (Ang-2), the receptor Tie2, VEGF-A and VEGF-C by real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) in a cohort of 126 patients with newly diagnosed de novo AML and 22 normal marrow donors. The results were correlated with clinical features and outcome of the patients.
RESULTS. Expression of Ang-1, Ang-2 and VEGF-A was significantly higher and that of VEGF-C was lower in AML patients than in normal controls. Only unfavorable karyotype and higher expression of Ang-2, but not other angiogenic factors, were independent prognostic factors for overall survival by multivariate analysis, with a hazard ratio of 2.19 (95%CI, 1.27-3.77, P=0.005) and 2.05 (95%CI, 1.20-3.52, P=0.009), respectively. The prognostic significance of Ang-2 expression was more obvious in the subgroup of patients with intermediate-risk cytogenetics (P=0.004). Subgroup analysis showed that Ang-2 expression had prognostic impact on patients with low (but not high) Ang-1 or Tie2 levels, and on patients with high (but not low) VEGF-A or VEGF-C levels.
CONCLUSIONS. These results provide evidence that high pre-treated levels of Ang-2 in the bone marrow indicate an unfavorable prognosis in AML.

並列關鍵字

AML ； angiopoietin ； VEGF ； survival

參考文獻

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