- 學位論文
紅樹林沉積物中脫氮細菌之研究
The Study of Denitrifying Bacteria from Mangrove Sediments
摘要
脫氮作用為地球生態系氮循環的重要過程。具脫氮能力之細菌則種類繁多，並不侷限於單一菌屬或菌種。本研究針對台灣北部河口紅樹林，包括挖仔尾、竹圍、關渡、紅毛港、客雅溪口和中港溪口等處沉積物中的脫氮細菌菌相進行研究。使用 PYN (polypepton-yeast-nitrate) 液體培養基，配合最可能數計數法 (most-probable-number counts，略稱 MPN counts)，估得各地紅樹林沉積物中，脫氮菌數約介於 2.6×104 至 1.2×105 cells/g wet wt. 間。自沉積物樣本中共分得 101 株脫氮分離株，經 AluI 和 RsaI 兩種限制內切酶，進行其 16S rRNA 基因之限制酶片段長度多型性 (restriction fragment length polymorphisms，略稱 RFLP) 圖譜之分析後，共可分為 21 個菌群。在進行多項生理生化特性檢測後發現，其中 66 株 (65.3 %) 具鈉鹽生長需求，應屬海洋原生種細菌。所有分離株中有 28 株 (27.7 %) 能行發酵作用，屬於兼性嫌氣性脫氮細菌。分析各菌群內各地代表株 16S rRNA 基因序列之親緣關係後顯示，自各地區紅樹林沉積物中所得之脫氮分離株分屬於 11 個菌屬，其中以 Marinobacter、Shewanella 和 Oceanimonas 等菌屬為主要組成。 所分得脫氮分離株中，編號為 CK1和K12，分別分離自中港溪口和關渡的菌株，除脫氮能力外，亦同時具發酵能力，屬於異營性、兼性嫌氣性，藉單根極鞭毛進行運動之革蘭氏陰性桿菌。在嫌氣狀態下，它們都能利用硝酸根或氧化亞氮作為電子接受者，進行脫氮生長；亦能利用葡萄糖或蔗糖等碳水化合物作為基質，進行發酵生長。CK1 和 K12 最適合生長於 30 ºC 至 35 ºC 和 pH 7。它們皆無鈉鹽生長需求，但最適合生長於氯化鈉濃度為 1 % 至 3 % 之環境；兩分離株中只有 K12 能在13 % 至 14 % 之氯化鈉濃度下生長。16S rRNA 基因序列分析顯示，CK1和 K12 的序列相似度為 96.8%；且與已知最相近菌種 Oceanimonas doudoroffii、Oceanimonas baumannii、Oceanimonas smirnovii 和 Oceanisphaera litoralis 在親緣樹上明顯分歧，彼此之間只具有94.1 % 至 96.8 % 的序列相似度。在細胞脂肪酸方面，CK1 和 K12 皆以 C18:1ω7c (32.6-35.7%)、C16:1ω7c (27.5-29.4%) 和 C16:0 (20.1-22.0%) 為主要組成，不同於 Oceanimonas 和 Oceanisphaera 所含菌種皆以 C16:1ω7c 為主。以G + C含量而言，CK1和K12的62-64 mol%，亦與 Oceanimonas 和 Oceanisphaera 屬所含菌種之54-59 mol% 明顯有別。多元分類數據顯示，CK1和K12 兩脫氮分離株應為不同種，且可歸類為屬於γ-Proteobacteria 之新屬細菌。目前已將其歸屬於 Zobellella 此新的菌屬，分別命名為 Zobellella denitrificans 和 Zobellella taiwanensis，並以 Zobellella denitrificans 為此菌屬之標準種。相關論文並已發表於 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 期刊 (Lin, Y.-T. & Shieh, W. Y. Int J Syst Evol Microbiol (2006). 56, 1209-1215)。 除了針對紅樹林沉積物中脫氮細菌的多樣性，及分類地位進行研究外，本研究亦利用屬於亞硝酸根還原酶 (nitrite reductase) 基因 (nirK 和 nirS) 中保守區域的引子對，透過聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction，略稱 PCR) 分析脫氮分離株具有的 nir 形式。所得 101 個脫氮分離株中，有 64 株 (63.4 %) 含有 nirS 基因，僅 16 個 (15.8 %) 分離株帶有 nirK 基因，其餘 21 株則尚無法以此些引子對確定其亞硝酸根還原酶形式。分析部分分離株 nir 基因片段序列之親緣關係顯示，此些分離株具有之 nirK 基因與已知者具高度差異，序列相似度皆不及 80 %，而 nirS 基因與目前已知者則較為相近，序列相似度皆高於 93 %。