核酸內切酶第五型主導之修復系統於試管中亞黃嘌呤核酸修復區段之分析

The Repair Patch Mapping of Endonuclease V-Mediated Alternative Excision Repair of Deoxyinosine in vitro

王議霆(Yi-Ting Wang)

指導教授 ： 方偉宏

國立臺灣大學/醫學院/醫學檢驗暨生物技術學研究所/碩士(2010年)

https://doi.org/10.6342/NTU.2010.02448

摘要

亞黃嘌呤 (hypoxanthine, hx)是腺嘌呤(adenine)經由外源性或自發性刺激，進行去胺化作用(deamination)的產物，與五碳糖結合時，稱之為亞黃嘌呤核酸(deoxyinosine, dI)。亞黃嘌呤核酸(dI)在DNA複製時傾向於與dC配對，如未修復則將會形成A to G的transition mutation產生。
目前已知大腸桿菌會利用endonuclease V-mediated alternative excision repair (AER)的途徑修復DNA中的亞黃嘌呤核酸 (dI)，先前本實驗室以受質dI-G，建構出endonuclease V (endo V), DNA polymerase I (Pol I）,以及DNA ligase的參與即可對dI進行修復。本實驗即以上述成果為基礎，進一步研發建構出更具生理意義的dI-T配對受質，以大腸桿菌萃取液與純化蛋白系統分析其修復機制；以及探討dI在純化蛋白系統中修復時涉及的修復區段長度分析。
我們設計出的dI-T受質在試管中以細胞萃取液修復證明了對於Endo V與Pol I的3’-5’exonuclease活性具有極高的依賴性；並使用3’-5’exonuclease活性缺失的Klenow fragment、正常Klenow fragment及Pol I於純化蛋白系統之修復情形作比較，證實3’-5’exonuclease活性的必須性。分析修復區段的研究則是在補齊正確配對時以放射性同位素標定，進而偵測訊號位置來分析修復區段的範圍。由實驗結果得知，修復系統在移除dI之後將繼續往5’端上游額外移除核苷酸，從endo V所造成的nick處向5’端移除約四個核苷酸，也就是於dI移除後，將往上游多移除兩個核苷酸，第五個核苷酸之後只有約為背景值的訊號表現。至於3’端下游方向，有小一部分的放射線訊號持續存在，長度約是Pol I作用一到兩次的聚合過程，推測是Pol I所造成的nick translation情形。此nick translation反應並不是dI修復時必要的作用。
核酸修復的研究指出nick translation是short-patch與long-patch轉變的重要關鍵之一，也曾有in vivo的研究觀察到dI的修復區段範圍是為五個核苷酸的短片段，或許細胞內的修復可能有其他我們未知的因子涉及，以調控nick translation的發生，如參與在nucleotide excision repair (NER)當中的UvrD protein (DNA helicase II)，即是會影響long-patch repair出現與否的一個重要因子。

關鍵字

核酸內切酶第五型 ； 亞黃嘌呤 ； 修復區段 ； 細胞萃取物 ； 突變噬菌體 ； 放射線同位素 ； 純化蛋白修復系統

並列摘要

無資料

並列關鍵字

Escherichia coli ； Endonuclease V ； endonuclease V-mediated alternative excision repair(AER) ； hypoxanthine ； deoxyinosine ； 3’-5’exonuclease ； nick translation ； purified protein system

參考文獻

尤詠絮, (2009) 亞黃嘌呤核酸鹼基切除修復試管中測定系統之研發，國立台灣大學碩士論文。

Cooper P.K. (1982) Characterization of long patch excision repair of DNA in ultraviolet-irradiated Escherichia coli: an inducible function under rec-lex control. Mol Gen Genet 185:189-97.

Dalhus B., Arvai A.S., Rosnes I., Olsen O.E., Backe P.H., Alseth I., Gao H., Cao W., Tainer J.A., Bjoras M. (2009) Structures of endonuclease V with DNA reveal initiation of deaminated adenine repair. Nat Struct Mol Biol 16:138-43.

Fang W., Wu J.Y., Su M.J. (1997) Methyl-directed repair of mismatched small heterologous sequences in cell extracts from Escherichia coli. J Biol Chem 272:22714-20.

Gough J.A., Murray N.E. (1983) Sequence diversity among related genes for recognition of specific targets in DNA molecules. J Mol Biol 166:1-19.