硫醇與胺基雙官能基修飾之矽奈米粒的製備與性質研究:應用於反譯寡核苷酸之遞送

Preparation and Characterization of Thiol and Amine Bifunctionalized Silica Nanoparticles: Application to Delivery of Antisense Oligonucleotides

王思元(Su-Yuan Wang)

指導教授 ： 邱士娟

共同指導教授 ： 胡德民(Teh-Min Hu)

臺北醫學大學/藥學院/藥學系(碩博士班)/碩士(2013年)

摘要

矽奈米粒 (silica nanoparticles; SiNPs) 是近年來藥物製劑上的研究趨勢，目前相關研究已證實SiNPs具生物相容性 (biocompatibility)。傳統製備SiNPs的方法稱作Stober method，此法係利用有機矽酸衍生物在鹼性的酒精溶液中，經過水解及縮合反應後而合成奈米粒子。SiNPs的粒子表面可進行有機官能基的修飾，使其具多功能的用途。本實驗之目的為： (1) 發展出簡便合成SiNPs之方法，使SiNPs帶有硫醇 (SH) 和胺基 (NH2) 兩種官能性基團；(2) 探討SiNPs承載反譯寡核苷酸 (ODN) 之吸附及釋放特性；(3) 探討SiNP-ODN製劑之細胞攝入 (cellular uptake) 及細胞毒性 (cytotoxicity)。本研究使用兩種矽源 (silica source): 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) 和3-mercaptopropyl trimethoxysilane (MPTMS) 進行SiNPs之製備，將不同比例的矽源在酸性有機溶劑中反應，經過相轉移後，在水相中析出成粒子。為了能進一步瞭解此系統，我們嘗試改變不同的實驗條件。
實驗結果顯示，影響SiNPs生成的主要因素為：矽烷組成比例、矽烷總濃度、反應時間、注射體積和反應溫度。當APTMS佔組成的1-25 %，可生成200 - 300 nm穩定大小的SiNPs；SiNPs上硫醇的濃度是隨著參與反應的MPTMS比例越高而增加；各比例SiNPs的表面所帶電荷皆大於+ 30 mV，電荷是隨著參與反應的APTMS比例越高而提高； SiNPs的分子鍵結 (Si) 是以約1:1的T2和T3形成網狀致密的圓球體構型。細胞試驗結果顯示，SiNPs能有效遞送FITC-G3139 (FITC螢光標記之ODN) 進入細胞，且可提升doxorubicin對血液腫瘤細胞K562和CCRF-CEM的抑制生長作用。
結論：本研究發展出新穎、簡便的方法，利用ouzo effect製備表面具SH與NH2雙官能基修飾的矽奈米粒，所製備的SiNPs表面帶正電荷且具有良好的膠體安定性 (colloid stability)，預期此法所製備的SiNPs具有廣泛的應用性。

關鍵字

矽奈米粒、反譯寡核苷酸、fluorescence quenching、藥物遞送、MTS assay

並列摘要

目錄
中文摘要 VI
英文摘要 VIII
圖目錄 X
表目錄 XIV
縮寫表 XV
第一章、緒論 1
第一節、矽奈米粒 1
一、矽奈米粒的合成與修飾 1
二、矽奈米於藥物遞送之研究 2
三、矽奈米粒之藥物動力學特性 5
四、矽奈米力之細胞攝入特性 5
五、矽奈米粒於藥劑學之應用 6
六、矽奈米粒於生物醫學之應用 6
第二節、烏走效應 (Ouzo effect) 9
第三節、基因遞送系統 14
一、病毒載體 14
二、非病毒載體 14
第四節、基因治療 18
一、RNA干擾 (RNA interference) 19
二、核酸酵素 (Ribosome enzyme) 19
三、反譯寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides) 19
第五節、反譯寡核苷酸 20
第六節、細胞凋亡 25
一、外生性路徑的細胞凋亡 25
二、內生性路徑的細胞凋亡 26
三、Bcl-2蛋白家族 28
第七節、Doxorubicin 30
第八節、研究動機與目的 32
第二章、材料與方法 33
第一節、材料 33
一、實驗細胞 33
二、實驗藥品 33
三、實驗儀器 35
第二節、實驗方法 36
一、製備及收集矽奈米粒 36
二、矽奈米粒與ODN結合與釋放試驗 43
三、瓊脂凝膠電泳分析FITC-ODN的吸附級釋放性質 47
四、硫醇之定量分析 48
五、元素分析 49
六、矽譜之固態核磁共振光譜分析 49
七、穿透式電子顯微鏡 50
八、細胞培養 51
九、MTS比色試驗 53
十、雷射掃描式共軛焦顯微鏡 54
十一、流式細胞儀 55
第三章、結果 57
第一節、矽奈米粒之物理化學性質 57
一、調控不同參數來製備矽奈米粒 57
二、矽奈米粒之表面電荷 75
三、矽奈米粒之膠體安定性試驗 76
四、矽奈米粒之型態 81
五、矽奈米粒上的硫醇之定量分析 83
六、矽奈米粒之元素分析 85
七、矽奈米粒之29Si固態核磁共振光譜分析 87
八、相圖 (phase diagram) 90
第二節、劑型特性探討 92
一、矽奈米粒承載及釋放反譯寡核苷酸能力 92
二、瓊脂凝膠電泳分析FITC-ODN吸附及釋放性質 104
三、承載FITC-ODN矽奈米粒之型態 108
第三節、矽奈米粒劑型之細胞試驗 110
一、細胞攝入試驗 110
二、反譯寡核苷酸劑型與化療藥物合併之細胞存活率試驗 118
第四章、討論 122
第一節、探討雙官能基修飾的SiNPs之製備 122
一、探討各種參數對SiNPs之生成影響 123
二、探討如何純化及收集SiNPs 127
三、探討SiNPs的物理化學結構及特性 128
四、SiNPs與FITC-ODN的吸附行為 129
五、SDS和pH值對FITC-ODN-SiNPs釋放行為之影響 131
第二節、探討FITC-ODN-SiNPs之細胞攝入及毒殺作用 133
一、細胞攝入游離態FITC-ODN與FITC-ODN-SiNPs劑型 133
二、細胞毒性試驗 134
第五章、結論與展望 136
參考資料 138
附錄 149

並列關鍵字

silica nanoparticle、antisense oligonucleotide、fluorescence quenching、drug delivery、MTS assay

參考文獻

1. Halas, Nanoscience under glass: the versatile chemistry of silica nanostructures. ACS Nano, 2008. 2(2): p. 179-183.

2. Angelos, Liong, Choi and Zink, Mesoporous silicate materials as substrates for molecular machines and drug delivery. Chemical Engineering Journal, 2008. 137(1): p. 4-13.

3. Stober, Fink and Bohn, Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. Journal of Colloid and Interface Science, 1968. 26(1): p. 62-69.

4. Hoffmann, Cornelius, Morell and Froba, Silica-based mesoporous organic–inorganic hybrid materials. Angewandte Chemie International Edition, 2006. 45(20): p. 3216-3251.

5. Nakamura, Shono and Ishimura, Synthesis, characterization, and biological applications of multifluorescent silica nanoparticles. Analytical Chemistry, 2007. 79(17): p. 6507-6514.