胃癌分子標記之研發暨致癌因子之分子機制探討

Identify the novel molecular markers and the investigation of the molecular mechanism of gastric cancer

吳昌翰(Chan-Han Wu)

指導教授 ： 林綉茹

共同指導教授 ： 王照元(Jaw-Yuan Wang)

高雄醫學大學/醫學院/醫學研究所/博士(2008年)

https://doi.org/10.6832/KMU.2008.00009

摘要

胃癌位居台灣地區癌症死因第四位已經二十餘年，雖然臨床上治療胃癌的技術越來越精進，已能為部分病患提供較好的預後，但有效提升胃癌病患五年存活率仍有賴於早期診斷，另一方面手術後的病患伴隨著高比例的術後病灶轉移以及復發，使手術後的監控難度增加，由於臨床上仍缺乏良好的監測工具，因此發展一個高靈敏度、高特異性而易於檢測的方法來偵測早期胃癌，便成了刻不容緩的工作了。透過癌細胞轉移假說的建立，證據顯示轉移的癌細胞在腫瘤發生的早期，便會透過血液或淋巴等循環系統，分散到其他的器官，因此本論文的研究重點，就是利用檢測周邊血液中循環癌細胞所表現之分子標記，作為癌症早期診斷及術後監測的工具。吾人首先利用RT-PCR分析四個mRNA分子標記在胃癌病患體內的表現，這四個分子標記分別是hTERT，CK-19，CK-20以及CEA(carcinoembryonic antigen)，吾人針對病患進行病灶切除手術時採集的周邊血液樣本同時以健康族群作為對照組，以比較分子標記在兩種檢體中的表現情形來探討mRNA分子標記表現與胃癌臨床病理特徵之間的相關聯性，在這個部份吾人發現CEA可以反應胃癌病灶的轉移或復發，對於胃癌病患術後的追蹤相當有幫助，未來可以發展為臨床預後的預測因子。確認分子標記可以利用RT-PCR來偵測其表現，並且可以藉以反映周邊循環癌細胞的活性之後，有鑒於RT-PCR只能於一次實驗中偵測一種分子標記的活性，在效率上有其限制，吾人進而以一個新的技術平台：呈色型檢測晶片進行分子標記表現的分析，希望能藉著多分子標記的檢測方式，在提高檢測效率的同時，也能提升偵測周邊循環癌細胞的靈敏度、特異性以及正確性。這個階段選用的四個分子標記為hTERT，CK-19，CEA以及MUC-1，同樣以胃癌病患血液樣本與健康族群為實驗材料，探討mRNA分子標記之表現與胃癌臨床病理特徵之間的相關聯性，同時為了驗證這個技術平台對檢測周邊循環癌細胞的靈敏度，又加入人類胃癌細胞株KATO-III序列稀釋定量實驗，吾人發現周邊血液中每5毫升有超過25個循環癌細胞的時候，就可以利用mRNA檢測晶片技術平台將癌細胞偵測出來；而這四個分子標記進行生物統計分析的結果也顯示，mRNA檢測晶片較傳統RT-PCR等檢測方法有更高的靈敏度與特異性，吾人認為這樣一個高效率的技術平台將有機會開發為臨床輔助診斷胃癌的工具，並可進一步作為臨床胃癌早期診斷以及預測胃癌病患術後是否發生病灶轉移與復發。由前面的經驗已經可以證明分子標記確實能應用於偵測周邊循環癌細胞的活性，不過可應用在胃癌診斷的分子標記卻相當有限，為了研發更多在胃癌病患體內高度表現以及具有胃癌腫瘤專一性兩種特性的分子標記，吾人接著進行微矩陣列分析比較胃癌組織與鄰近正常組織之間的差異性表現基因，透過生物資訊軟體的統計分析挑選出可能具有胃癌特異性的分子標記基因群，共計五十六個基因，接著以呈色型檢測晶片對胃癌組織標本進行測試，確認這些基因是否具有高度表現以便進一步篩選，經過篩選過後的二十五個基因自成另一個基因群，繼續以血液樣本分析其表現情形，比較病患族群與健康族群的基因表現，同時探討這些分子標記與臨床病理資料之間的相關性，經由生物統計的運算分析，此基因群中的十五個基因表現可以區分病患族群與健康族群的明顯差異，單一基因標記靈敏度85％~93％，特異性87％~94％，將基因群組的表現量化之後，發現基因群表現的強弱分別與臨床病理資料如腫瘤大小、TNM期別、腫瘤細胞分化程度以及是否發生轉移與復發等，都有統計上的意義(p＜0.05)。有了這樣的結果，胃癌分子標記已經稍具規模，只要能累積更多的臨床檢體加以印證，並更進一步了解各個基因在胃癌腫瘤發生過程中扮演的角色，將來必能作為一個早期檢測胃癌的輔助工具；接著，吾人也探究分子標記在致癌機轉中扮演的角色，微矩陣列分析的結果在生物資訊軟體解讀之後，感染反應以及其下游相關路徑皆顯示有相當的重要性，而胃幽門螺旋桿菌又是人體胃部組織最具有代表性的病原體，因此吾人在此論文中便以胃幽門螺旋桿菌的感染以及其生物性影響作為標的，進行研究。吾人發現胃幽門螺旋桿菌雖然存在於多數胃癌組織樣本中，但尿素酶活性測試卻明顯有強弱之分，而且與胃幽門螺旋桿菌尿素酶基因群的表現相呼應。為了證實胃幽門螺旋桿菌分泌的尿素酶與胃癌的發生有關，吾人以胃幽門螺旋桿菌分泌液刺激NIH-3T3細胞株，結果證明胃幽門螺旋桿菌分泌液會促使細胞增生，而其所含尿素酶活性強弱則會決定細胞增生的程度，此外利用其它種會分泌尿素酶的細菌進行同樣的測試，並沒有觀察到細胞增生的現象，顯示胃幽門螺旋桿菌分泌液對刺激細胞增生有特異性，吾人藉此推論胃幽門螺旋桿菌所分泌之尿素酶與細胞轉型相關，並在胃癌腫瘤發生的過程，有一定程度的重要性。藉由本研究吾人（一）研發出可應用於胃癌診斷的分子標記基因群及（二）以生物功能確定胃幽門螺旋桿菌與胃癌致癌機轉的相關性，希望此二突破能為臨床上胃癌的診斷帶來新方向，使早期診斷及術後追蹤都能有更可靠的參考資訊，預期除了預防胃癌的持續惡化，也能進一步改善胃癌病患的五年存活率。

關鍵字

胃癌 ； mRNA分子標記 ； 早期偵測 ； 微矩陣列分析 ； 胃幽門螺旋桿菌

並列摘要

無資料

並列關鍵字

Gastric cancer ； mRNA marker ； early detection ； microarray ； Helicobacter pylori

參考文獻

Aloia, T., Bepler, G., Harpole, D., Goodman, P. C., McAdams, H. P., Erasmus, J. J., Herndon, J. E., and Patz, E. F., Jr. (2001). Integration of peripheral blood biomarkers with computed tomography to differentiate benign from malignant pulmonary opacities. Cancer Detect Prev 25, 336-343.

Bae, C. D., Sung, Y. S., Jeon, S. M., Suh, Y., Yang, H. K., Kim, Y. I., Park, K. H., Choi, J., Ahn, G., and Park, J. (2003). Up-regulation of cytoskeletal-associated protein 2 in primary human gastric adenocarcinomas. J Cancer Res Clin Oncol 129, 621-630.

Bai, V. U., Kaseb, A., Tejwani, S., Divine, G. W., Barrack, E. R., Menon, M., Pardee, A. B., and Reddy, G. P. (2007). Identification of prostate cancer mRNA markers by averaged differential expression and their detection in biopsies, blood, and urine. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 2343-2348.

Bilal, R., Khaar, B., Qureshi, T. Z., Mirza, S. A., Ahmad, T., Latif, Z., Jaffery, I., and Omar, M. (2007). Accuracy of non-invasive 13C-Urea Breath Test compared to invasive tests for Helicobacter pylori detection. J Coll Physicians Surg Pak 17, 84-88.

Blumke, K., Bilkenroth, U., Schmidt, U., Melchior, A., Fussel, S., Bartel, F., Heynemann, H., Fornara, P., Taubert, H., Wirth, M. P., and Meye, A. (2005). Detection of circulating tumor cells from renal carcinoma patients: experiences of a two-center study. Oncol Rep 14, 895-899.