奈米粒子系統應用: 酵素固化與高通量酵素篩選平台開發

Development of Nanoparticle-based System for Enzyme Immobilization and High Through-put Enzyme Screening

游景晴(CHING-CHING YU)

指導教授 ： 林俊成

國立清華大學/理學院/化學系/博士(2012年)

https://doi.org/10.6843/NTHU.2012.00210

摘要

近年來，將奈米粒子這類新穎的材料應用在生物體系統受到相當多的重視。結合奈米粒子與生物分子成為一個混合式的微小材料，其應用性可小到奈米等級的單一電子機制探討，也可大到生醫材料診斷方法的開發。
由於磁性奈米粒子本身所具有的高表面積-體積比以及其超順磁性，使得這類奈米材料成為一相當適合用在酵素固化的平台。本論文將利用此材料，並探討位向專一方式之酵素固定化。結合Intein蛋白質表達系統與磁性奈米粒子，透過Native Chemical Ligation (NCL)將CMP-sialic acid synthetase (CSS)與alpha-2,3sialyl -transferase (PmST1)固化於磁性奈米粒子上。不需經過繁瑣之純化步驟，就能將酵素C端位以位向專一性且共價鍵結方式固化於磁性奈米粒子，並且利用磁鐵就能夠快速地將酵素於反應溶液中分離。相較於傳統以隨機醯胺鍵形成進行酵素固定化，本方法以位向專一性方式固化，其酵素反應性較傳統固化方式高出許多。我們並探討酵素在磁性奈米粒子上的含量、酵素與磁性奈米粒子之間的連接長度與其反應活性的關係。我們成功結合兩種酵素功能化磁性奈米粒子進行一鍋化反應合成三醣體GM3衍生物。此外，固化後之酵素功能化磁性奈米粒子能夠長時間保存；於多次重複使用後，依然維持相當好之反應性。結合生物與奈米技術之酵素功能化磁性奈米粒子，不單單能夠應用於有機合成，酵素的回收再利用，更加提高了其經濟價值。
金奈米粒子由於其容易調控粒子大小、可修飾粒子表面、大的表面積/體積比與特殊的光學性質。因此金奈米粒子已被應用於與各種蛋白質、抗體、凝集素及小分子耦合，並有許多的應用。金奈米粒子由於其粒徑在數十奈米至數百奈米間，正好與蛋白質/酵素作用的細胞大小相近，因此金奈米粒子對醣類與蛋白質/酵素作用的研究，可說是一相當優良的載體。本論文將利用四醣體GD3包覆的13 nm金奈米粒子，透過alpha-2,8-polysialyltransferase (PST) 反應，在金奈米粒子表面合成聚唾液酸多醣體。並利用雙點突變之唾液酸水解酶，藉由其與聚唾液酸之間強大的作用力，以偵測聚唾液酸的生成。此方法採用比色法偵測聚唾液酸，並能夠在細胞粗萃液的環境之下進行聚唾液酸的偵測；不僅能在96孔盤中操作，並且免除了傳統ELISA偵測方法中繁複的清洗過程。

關鍵字

酵素固化 ； 磁性奈米粒子 ； 天然化學連結法 ； 唾液酸轉移酶 ； 金奈米粒子 ； 比色法 ； 聚唾液酸轉移酶 ； 聚唾液酸 ； 綠色化學

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enzyme immobilization ； magnetic nanoparticle ； native chamical ligation ； sialyltransferase ； gold nanoparticle ； colorimetric assay ； polysialyltransferase ； polysialic acid ； green chemistry

參考文獻

2. Koeller, K. M.; Wong, C.-H. Nature 2001, 409, 232.

4. Toscano, M. D.; Woycechowsky, K. J.; Hilvert, D. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 3212.

5. Sheldon, R. A. Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1289.

6. Hanefeld, U.; Gardossi, L.; and Magner, E. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 453.

8. Cao, L. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, 9, 217.