一氧化氮與APE1 在人類非小細胞肺癌細胞標靶治療的角色

The roles of nitric oxide and APE1 in the target therapy of human non-small cell lung cancer cells

趙文瑄(Wen-Hsuan Chao)

指導教授 ： 楊嘉鈴

國立清華大學/生命科學院/生物科技研究所/碩士(2014年)

摘要

EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)，包括erlitinib及gefitinib，是臨床治療使用的標靶藥物，可有效的治療EGFR突變的肺癌病患。然而，病患終究會產生復發。因此研究抗藥性機制在肺癌的標靶治療非常重要。我們最近結果推測一氧化氮跟肺癌細胞產生TKI抗藥性可能相關。為了繼續探討此推測，我使用對TKI敏感的肺腺癌細胞株PC9，以及長期處理gefitinib產生抗藥性的子細胞株，PC9/gefB4進行研究。利用MTT試驗分析PC9及PC9/gefB4對於erlotinib的耐受性，我確認PC9對erlotinib極為敏感，而PC9/gefB4則具有很強抗藥性。西方墨點法分析，發現erlotinib會抑制兩株細胞內的ERK1/2激酶的活性，但是對PC9抑制的程度較高，因而推測造成此二細胞株細胞抗藥性的差異不全然是ERK1/2活性降低所致。利用流式細胞儀搭配一氧化氮螢光偵測劑測量細胞內一氧化氮的表現量，我確認TKI處理時，PC9細胞內一氧化氮的表現量顯著地增高，但PC9/gefB4則否。一氧化氮清除劑PTIO可減緩erlotinib對於PC9細胞的毒性，推測TKI誘導一氧化氮生成可能有助於細胞死亡。APE1為一種多功能蛋白，具有核酸修補及氧化還原調控活性。在無藥物處理的控制組，PC9/gefB4的APE1表現量較PC9為高。處理10-30 nM erlotinib時，PC9及PC9/gefB4細胞的APE1表現量均會被誘發。為了瞭解APE1跟抗藥性之間的關聯性，我使用慢病毒RNA干擾系統，以shAPE1成功地降低細胞內APE1的表現量，並發現APE1的表現量對PC9細胞的生長可能有些貢獻，但對PC9/gefB4細胞生長的影響有限。移除PC9及PC9/gefB4細胞APE1時，磷酸化ERK的含量也隨著降低。移除APE1的PC9細胞可以提升erlotinib誘發的一氧化氮生成量。相反地，移除APE1的PC9/gefB4細胞，在erlotinib處理後卻降低一氧化氮的生成量。移除APE1可增加PC9細胞對高劑量TKI的耐受性，但對PC9/gefB4細胞不會影響。總而言之，TKI對PC9細胞誘發APE1表現量可拮抗一氧化氮的生成；而PC9/gefB4細胞含高量的APE1可能使TKI誘發一氧化氮的能力降低。

關鍵字

APE1 ； 非小細胞肺癌 ； EGFR ； TKI ； nitric oxide

參考文獻

Brownson, R.C., Alavanja, M.C.R., Caporaso, N., Simoes, E.J., and Chang, J.C. (1998). Epidemiology and prevention of lung cancer in nonsmokers. Epidemiol Rev 20, 218-236.

Bryan, N.S., Rassaf, T., Maloney, R.E., Rodriguez, C.M., Saijo, F., Rodriguez, J.R., and Feelisch, M. (2004). Cellular targets and mechanisms of nitros(yl)ation: An insight into their nature and kinetics in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 101, 4308-4313.

Carr, A.C., McCall, M.R., and Frei, B. (2000). Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species - Reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscl Throm Vas 20, 1716-1723.

Chang, T.H., Tsai, M.F., Su, K.Y., Wu, S.G., Huang, C.P., Yu, S.L., Yu, Y.L., Lan, C.C., Yang, C.H., Lin, S.B., et al. (2011). Slug confers resistance to the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor. Am J Resp Crit Care 183, 1071-1079.

Chen, K.L., Chang, W.S.W., Cheung, C.H.A., Lin, C.C., Huang, C.C., Yang, Y.N., Kuo, C.P., Kuo, C.C., Chang, Y.H., Liu, K.J., et al. (2012). Targeting cathepsin S induces tumor cell autophagy via the EGFR-ERK signaling pathway. Cancer Lett 317, 89-98.