核酸滾動循環擴增技術於側向流免疫層析法上對禽流感序列之快速偵測

Development of DNA Rolling Circle Amplification Technology On Lateral-Flow Immunochromatography Detection of Avian Influenza

許曜薪(Yao-Hsin Hsu)

指導教授 ： 吳瑞璋

中原大學/工學院/化學工程研究所/碩士(2009年)

https://doi.org/10.6840/CYCU.2009.00742

摘要

核酸側流免疫層析法（OLFIA），為利用核酸序列之互補原理，於試片膜上偵測特定基因序列之專一性表現。其優點為檢測快速，且核酸不具毒性，因此在操作上也不會有安全上的疑慮；缺點為在獲取病原體核酸的步驟上十分繁雜；以流感病毒基因結構為例，因其為單股RNA，故必須先利用反轉錄酶將RNA轉錄成cDNA，再經由PCR擴增進而濃縮成實驗操作所需濃度；反之，若是直接利用病毒抗原抗體專一性結合進行相同實驗設計，就不會有如此疑慮，但相對的，病原體對人體的感染防範就成了棘手的問題。

本實驗中利用人類禽流感病毒H5基因序列中的358mer片段作為目標物DNA (Target)，設計一段末端與其互補的RCA 環狀模版探針，與其黏合後加入RCA材料並在固相硝化纖維膜上進行恆溫DNA擴增，最後再以螢光探針顯色達成訊號放大，替代抗體、抗原分析法來偵測禽流感DNA序列。由於實驗採雜合反應做為檢測基礎，因此檢測方式非常簡便，目標物DNA序列首先以聚合酶鏈鎖反應（PCR）進行擴增，在二次不對稱PCR中，加入由生物素biotin修飾的Forward Primer，使其最終夾出358mer biotin-labeled的H5單股序列DNA，最後再稀釋成實驗所需的不同目標物DNA濃度。

檢測試片方面，在結合墊上預先以TLC點樣設備點樣上特定濃度的RCA 環狀模版探針，測試線上印製上能於biotin有高度親合鍵結力的streptavidin；接著則在樣品墊上滴入不同濃度的目標物H5 Target DNA。目標物H5 Target樣品在滴入樣品墊後，會以毛細動力的方式向前移動，此時，若反應為陽性反應，則目標物DNA便會和RCA環狀模版探針進行專一性雜合，雜合產物會因目標物DNA尾端修飾biotin的因素，在經過測試線時被streptavidin捕捉，最後進行固相RCA後而顯色；反之，若為陰性反應，則目標物DNA和RCA環狀探針無法進行專一性雜合，在測試線上也不會有訊號出現。本實驗主要對H5目標物DNA進行專一性測試，並觀察標的物的添加在不同濃度下，是否對RCA訊號造成影響，最後再進行偵測極限測試，以及延長RCA反應時間對訊號的影響等等。

關鍵字

核酸側流免疫層析法 ； 生物感測 ； 硝化纖維膜 ； 快速偵測試片 ； 核酸滾動循環擴增技術

並列摘要

Rolling Circle Amplification (RCA) is an elegant biochemical method by which long single-stranded DNA molecules with a repeating sequence motif can be readily synthesized.

Our research utilizes this DNA amplification technique as a basis to prove that Solid-Phase RCA not only could perform on the surface of Bio-Chip butalso on Lateral-Flow rapid-test nitrocellulose membrane.

With this technology, in the future, we just need to design a RCA primer wh-ich sequence could conjugate with the RCA circular template and Target DNA, then, we could test the
specificity of any DNA Targeton the rapid-test membrane without large amounts of sample,the
effect of signal amplification could see.

Before this research was finished, we’ve already tried a lot of methods to make this solid-phase RCA worked on a rapid-test membrane. Finally, we got a best way that as long as we put the cutmembrane into the bottom of the 1.5CC tube’s cover which was fi-lled with the RCA cocktails,thus, we could get the most apparent signal on membrane, and the intensity of the RCA signal could even tend to be saturated.(Figure4-strip4), proving the success and thefeasibility of RCA on the nitrocellulose membrane.

In the future,we further intend to utilize this method on DNA target detection totest the specificity of different sequences of DNA.

並列關鍵字

Rolling Circle Amplification (RCA) ； Rapid-test strip ； Bio-sensor ； Lateral-Flow immunochromatography ； Nitrocellulose membrane

參考文獻

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