整合以奈米鑽石為基材的親和性萃取和質譜方法於磷酸化蛋白質體學的研究

本論文的研究目的是發展一套對磷酸化蛋白質萃取和分離的新方法，以利在質譜上分析蛋白質的磷酸化位置和後續的蛋白質體學研究。過去的磷酸化蛋白質體學研究方法多為分析胜肽的磷酸化位置(peptide level information)；但如果只對胜肽上磷酸化的位置分析研究很有可能失去很多與磷酸化蛋白質分子的重要資訊（protein level information）。本論文分成兩個部分，第一部分使用聚精胺酸的奈米鑽石萃取分析HeLa cell line中的磷酸化蛋白質，經過酵素消化後再使用Metal oxide affinity chromatography (MOAC)萃取含有磷酸化訊息的胜肽片段。此為一種top-down的分析流程，結合質譜技術我們會得到蛋白質上磷酸化位置的重要資訊。論文的第二部分將研究Heptoma Up Ragulated Protein(HURP)，HURP也被稱為DLG7，他的功能性被磷酸化位置高度調控，在細胞分裂時扮演著重要的角色並且在癌細胞內也被高量表現。本篇將以質譜技術分析與HURP有重大相互關係的蛋白質，以及HURP對細胞週期和細胞轉型具有重大影響的磷酸化和甲基化位置，而這些預測到的後轉譯修飾位置和潛在有重大相關的蛋白質將再進行in vivo的實驗測試對細胞的實際影響。本篇結合了聚精胺酸和質譜蛋白質體學的工作流程，分析萃取HeLa cell line磷酸化蛋白質以及HURP的磷酸化位置分析；而這套新的分析方法已經成功的應用在磷酸化蛋白質研究上，對未來的磷酸化蛋白質體學研究有很大的幫助。

關鍵字

奈米鑽石；磷酸化蛋白質； HURP ；液相層析串聯式質譜儀

並列摘要

In this article, a sensitive ND-based analytical strategy for on-probe concentration and phosphorylation site characterization of HURP protein from HeLa cell lysates is presented. Affinity captured HURP proteins on NDs were directly subjected to 1-D PAGE for phosphoprotein fractionation. After in-gel digestion, phosphorylation sites in HURP proteins were thus characterized by ND-based two-step affinity purification prior to the MALDI-TOF MS analysis. Potential novel phosphorylation and dimethylation sites in HUPR proteins were identified and further functional studies of these modification were in collaboration with Dr. RickyYu in NCNU. The presented approach for the characterization of phosphorylation sites in HURP proteins is a successful model of how the ND-based affinity purification can be incorporated with mass spectrometry-based phosphoproteomic studies. Current progress and further perspectives are discussed.