建立一套利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法同步對多種植物激素定量的客製化方法

A customized method for rapid simultaneously identification of multiple plant hormones by MALDI-TOF MS

柯竣智(Chun-Chih Ko)

指導教授 ： 吳志哲

國立暨南國際大學/科技學院/應用化學學系/碩士(2021年)

https://doi.org/10.6837/ncnu202100400

摘要

基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF MS)能快速的同時偵測多種分析物樣品，是進行大批量產品篩檢的一套有力分析工具。我們計畫利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法針對植物激素小分子進行偵測，針對選定的三種植物激素小分子: 氯化膽鹼 (Choline chloride)、吲哚-3-丁酸 (IBA)、激動素 (Kinetin)，客製化一套定量分析策略。首先藉由分析植物激素分子的分佈係數 (Distribution coefficient)參數為條件，來挑選合適的內部標準品；並選擇合適基質以確保分析物訊號之特異性；將基質和樣品混合物透過真空乾燥處理以漸少甜蜜點效應的干擾；另用異丙醇/正己烷溶劑對載體表面進行預處理以濃縮樣品於鋼盤上的結晶面積。透過優化一系列的定量分析條件，我們建立一套以褪黑激素 (Melatonin)為內部標準品，來對三種植物激素進行質譜定量分析的標準操作流程。
實驗結果顯示，這套方法具良好的實驗再現性。在三種不同分析物的標準樣品定量結果顯示，定量濃度的當日與異日偏差值都低於13%，定量濃度範圍內也都具良好的線性關係 ( R^2 >0.99)。雖然在三種標準品的混合物中，相對標準偏差會受到氯化膽鹼的影響而上升至 21%，不過在定量實驗上得到可接受的定量準確度 (Recovery: 83 % ~ 102 %)。之後，我們將這套定量分析方法應用在分析廠商提供的植物激素產品中Choline chloride、IBA、Kinetin的濃度，並對經過三種不同溫度貯存條件(高溫、常溫、低溫)處理後之植物激素產品進行濃度變化分析，發現經高溫 
貯存條件或低溫貯存條件處理之後的產品中，氯化膽鹼的濃度沒有顯著的改變，證實該植物激素產品的貯存安定性，可以符合美國環保署農業用藥的保存要求。我們預期這一套客製化的植物激素質譜定量分析方法可以作為一個快速且高通量的篩檢工具，用來確保植物激素產品的生產品質。
為了滿足未來大批量植物激素產品的分析需求，並因減少人為操作產生的實驗誤差，我們也針對這三種植物激素樣品客製化建立一套質譜儀自動化定量操作流程。在質譜儀器控制參數條件的優化設定上，得出以每發射15發雷射脈衝後，隨機改變作用位置，並累計315發射脈衝為最優化設定，並驗證自動化定量操作的實驗結果與人工手動操作的實驗結果，數據上不存在顯著差異。
我們針對氯化膽鹼、吲哚-3-丁酸、和激動素植物激素小分子的高通量樣品篩檢需求，所開發的客製化的MALDI-TOF MS定量偵測實驗操作流程。其特點有: (一)以單一內標準品，來同時對氯化膽鹼、吲哚-3-丁酸、激動素三種植物激素進行相對定量分析 (二) 能對市售植物激素產品進行快速且準確的濃度量化分析 (三) 結合質譜儀器的自動化操作設定，能有效的縮減實驗時間和人為操作誤差，達到進行高通量產品篩檢的目的。我們預期這套高通量質譜定量分析方法，也能應用於分析不同的植物激素小分子，藉由MALDI-TOF MS具有的快速、高通量且能自動化大批量實驗等優點，來針對不同植物激素分子，設計並提供一套客製化的質譜定量分析流程。

關鍵字

植物激素 ； 褪黑激素 ； 吲哚-3-丁酸 ； 激動素 ； 氯化膽鹼 ； 定量分析 ； 基質輔助雷射脫附遊離飛行時間質譜儀

並列摘要

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), is an effective analysis tool for high-throughput screening of small molecules. Here, we have explored to detect and quantify three targeted plant hormones ( Choline chloride, indole-3-butyric acid (IBA), Kinetin) by MALDI-TOF MS, and establish a customized procedure for high-throughput quantitative analysis. Melatonin was used as an internal standard for quantifying three plant hormones and the sample preparation protocol for MALDI-TOF MS analysis was optimized.
The results demonstrated this customized method is suitable for rapid screening of choline chloride, indole-3-butyric acid, and kinetin. The RSD values of three hormone standards are less than 13 %. However, the overall accuracy will be hampered by the presence of choline chloride in the mixture. The RSD value will be increased to 21 %. The method was further applied to quantify the concentrations of choline chloride, indole-3-butyric acid, and kinetin in the commercial samples, pretreated under different storage conditions, and showed that the concentration of choline chloride was unchanged after thermal treatment.
To achieve a high-throughput analysis of the plant hormones, the instrument settings for automated data acquisition in MADLI-TOF MS were optimized. High reproducible data can be obtained with an optimal number of laser shots, laser energy, and sample scanning method. The reproducibility of automated data acquisition is comparable to the manual, suggesting that this method may apply to the mass screening of plant hormones.
With this rapid, accurate, and high throughput customized method, a single analysis can be completed in less than 3 min. Expect this method can be used for qualitative and quantitative characterization of commercial plant hormone products and quality control.

並列關鍵字

Plant hormones ； Melatonin ； IBA ； Kinetin ； Choline chloride ； Quantification ； MALDI-TOF MS

參考文獻

參考文獻

1. Zhao, H.; Wang, Y.; Jin, Y.; Liu, S.; Xu, H.; Lu, X., Rapid and sensitive analysis of melatonin by LC-MS/MS and its application to pharmacokinetic study in dogs. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 2016, 11 (2), 273-280.

2. Ferreira, M.; de Oliveira, D.; Mesquita, C.; Barbosa, A.; Anhê, G.; Catharino, R., MALDI-MSI: a fast and reliable method for direct melatonin quantification in biological fluids. Journal of Analytical Science and Technology 2016, 7.

3. Fingrut, O.; Flescher, E., Plant stress hormones suppress the proliferation and induce apoptosis in human cancer cells. Leukemia 2002, 16 (4), 608-616.

4. Li, L.; Li, C.; Sun, J.; Sheng, J.; Zhou, Z.; Xin, M.; Yi, P.; He, X.; Zheng, F.; Tang, Y.; Li, J.; Tang, J., The Effects of 1-Methylcyclopropene in the Regulation of Antioxidative System and Softening of Mango Fruit during Storage. Journal of Food Quality 2020, 2020, 6090354.