鴿子環狀病毒LAMP 診斷技術及單株抗體之開發

HASH(0xeaa12e0)

張宴菱(HASH(0xeaa1f30))

指導教授 ： 莊國賓

國立屏東科技大學/農學院/動物疫苗科技研究所/碩士(2013年)

https://doi.org/10.6346/NPUST.2013.00125

摘要

鴿子環狀病毒的感染在幼鴿及成鴿身上皆會發生，並且在世界各地都有病例出現。目前尚未有疫苗及市售的檢測試劑來預防環狀病毒的感染。只能用原位雜交法、點墨跡雜交法和PCR的方式去偵測環狀病毒的感染。在這個研究中，我們利用恆溫環型核酸增幅法(loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)的快速檢測技術來檢測鴿子的環狀病毒，它能在恆溫下一個小時內增幅大量的基因片段。我們設計鴿子環狀病毒LAMP的引子，並確認過它的反應時間、溫度、靈敏性以及專一性。結果顯示LAMP的靈敏度比PCR高100倍，最低能檢測到DNA 55fg/mL。專一性的部分與PCR一樣，在檢測多種疾病後只會診斷出鴿子的環狀病毒。最後在檢體組織DNA檢測上，PCR可診斷出受感染鴿子的效率為50％；LAMP則是85％。
另外，有研究指出，鴿子環狀病毒的外殼蛋白具有良好的抗原性，適合用來當作診斷的一個依據，因此我們選殖鴿子環狀病毒外殼基因(PiCV ORF C1)，利用原核表現系統(pGS-21a及pET-32a表現載體)大量誘導蛋白。經純化並以western-blot確認具抗原性後，將兩者以濃度100μg/mL免疫BALB/c小鼠及500μg/mL免疫紐西蘭大白兔，分別生產單株抗體及多株抗體，接著以免疫rpET-32a-PiCV-capsid protein的小鼠成功篩選出3株以ELISA及Western-blot檢測確定對於PiCV具有辨識能力的單株抗體；另外利用紐西蘭大白兔所生產的多株抗體也以Western-blot確認具有抗原性。
PiCV LAMP檢測方法將能協助研究人員短時間內方便且快速檢測出病鴿，及時的將其與健康者分開，或者可用來篩選符合疫苗施打的鴿子。而本實驗所生產的鴿子環狀病毒之單株及多株抗體在未來可被用來研發鴿子環狀病毒的膠體金快速檢測試劑以及免疫疾病診斷上的分析。

關鍵字

鴿子的環狀病毒 ； 恆溫環型核酸增幅法 ； 單株抗體

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無資料

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HASH(0xeaae1e0) ； HASH(0xeaae280) ； HASH(0xeaae320)

參考文獻

1. 林秋月. 有機磷農藥二氯松快速檢測試劑之開發. 生物工程學系所 碩士學位論文 2010.

4. Abadie J, Nguyen F, Groizeleau C, Amenna N, Fernandez B, Guereaud C, Guigand L, Robart P, Lefebvre B, and Wyers M. Pigeon circovirus infection: pathological observations and suggested pathogenesis. Avian Pathol 30: 149-158, 2001.

5. Abdul-Ghani R, Al-Mekhlafi AM, and Karanis P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for malarial parasites of humans: would it come to clinical reality as a point-of-care test? Acta Trop 122: 233-240, 2012.

6. Allan GM, Phenix KV, Todd D, and McNulty MS. Some biological and physico-chemical properties of porcine circovirus. Zentralbl Veterinarmed B 41: 17-26, 1994.

7. Bassami MR, Ypelaar I, Berryman D, Wilcox GE, and Raidal SR. Genetic diversity of beak and feather disease virus detected in psittacine species in Australia. Virology 279: 392-400, 2001.