登革熱為熱帶與亞熱帶地區盛行的傳染性疾病，登革病毒為黃病毒屬，藉由血清學鑑定可區別成四種型別。臨床上最嚴重的登革出血熱及登革休克症候群與二次感染不同型別之登革病毒有關，此外，感染登革病毒第二型之致死率也明顯高於其他型別。因此在臨床診斷上，登革病毒血清型的鑑定是非常重要的。傳統的登革病毒檢測方法，如病毒分離、血清學檢測及逆轉錄PCR等方法，在小體積樣品或低濃度標的分析時，常有耗時、操作複雜、靈敏度不足、選擇性不佳及無法定量等問題。因此，為了克服上述問題及達到早期診斷之目的，本研究已成功地發展出一套可以同步偵測兩種型別登革病毒，且操作簡單的病毒分型技術。
本研究所開發的奈米探針技術係使用兩種類型粒子：(1) 磁性微米粒子(MMP)－在其表面分別修飾一段登革病毒第一型及第二型的識別寡聚核苷酸，做為捕捉探針(Capture probe)；(2) 金、銀奈米粒子(Au-NP & Ag-NP)－在其表面分別修飾另一段登革病毒第一型及第二型辨識寡聚核苷酸，當作分辨型別的報告探針(Report probe)，最後再搭配ICP-MS的偵測，進行最終的鑑定及定量工作。
在本研究所建立的分析程序中，當檢測樣品中含有第一型或第二型登革病毒的寡聚核苷酸序列時，上述兩種粒子(MMP & NP)就會與之雜合形成一類似三明治(MMP/Target oligonucleotides/NP probes (Au-NPs 或 Ag-NPs)的結構。如此一來，即可利用磁鐵將所形成的三明治結構予以分離，最終僅需透過加熱的步驟，即可將三明治結構中的金或銀奈米粒子游離出來，並導入感應耦合電漿質譜儀進行分析。為達最佳的分析靈敏度，本研究中曾嘗試針對以下關鍵性參數，如磁性微米粒子探針濃度，奈米粒子探針濃度和清洗次數等進行最佳化探討。依照各項最佳化實驗的結果，本研究所開發的奈米探針技術可在2小時內，針對單一個體積為50 µL的樣品進行濃度低達10-13 M的病毒分型與定量分析。

中文摘要……………………………………………………………… I
英文摘要……………………………………………………………… III
誌謝…………………………………………………………………… V
目錄…………………………………………………………………… VI
圖目錄………………………………………………………………… X
表目錄……………………………………………………………… XIII
第一章 前言……………………………………………………………1
1.1 病毒簡介…………………………………………………………1
1.2 登革病毒簡介……………………………………………………2
1.3 傳統登革病毒檢測方法…………………………………………9
1.3.1 病毒分離……………………………………………………11
1.3.2 血清學檢測…………………………………………………12
1.3.3 逆轉錄聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR)………………………..12
1.4 同步偵測多種DNA序列的分析技術發展……………………16
1.5 研究目的與方法………………………………………………19
第二章 儀器分析及原理……………………………………………21
2.1 紫外光可見光吸收光譜儀……………………………………21
2.2 動態散射式粒徑分析儀………………………………………23
2.3 感應耦合電漿質譜儀 (ICP-MS)………………………………26
第三章 實驗部分…………………………………………………… 42
3.1 試劑……………………………………………………………42
3.2 藥品配製………………………………………………………44
3.3 合成銀奈米粒子………………………………………………45
3.4 DNA修飾之磁性微米粒子製備………………………………46
3.5 金奈米探針的製備……………………………………………48
3.6 銀奈米探針的製備……………………………………………49
3.6.1 銀奈米探針穩定性探討………………………………… 49
3.6.1.1 寡聚核苷酸探針(Oligonucleotide probes)和標的寡聚
核苷酸(Target oligonucleotide)的設計………………49
3.6.1.2 pH值對銀奈米探針合成的影響……………………51
3.6.1.3 利用二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)還原寡聚核苷酸序 列對寡聚核苷酸序列加載(DNA loading) 效率的影響......................................................51
3.7 MMP/Target/Au-NPs & Ag-NPs probes雜合最佳化條件之探討
……………………………………………………………………52
3.7.1 清洗次數對於訊號/背景比的影響………………………53
3.7.2 不同濃度磁性微米粒子對Target DNA序列雜合效率的影
響…………………………………………………………55
3.7.3 不同濃度奈米探針對Target DNA序列雜合效率的影響
……………………………………………………………56
3.7.4 DNA 探針選擇性探討……………………………………57
3.7.5 同步偵測登革病毒第一型及第二型之可行性評估………58
第四章 結果與討論…………………………………………………59
4.1 DNA修飾之銀奈米粒子穩定性探討…………………………59
4.1.1 自行合成銀奈米粒子的特性分析…………………………61
4.1.2 銀奈米探針的製備…………………………………………64
4.1.2.1 pH值對銀奈米探針合成的影響……………………64
4.1.2.2利用二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)還原寡聚核苷酸
序列對寡聚核苷酸序列加載(DNA loading)效率的影響
…………………………………………………………65
4.2 MMP/Target/Au-NPs & Ag-NPs probes雜合最佳化條件之探討
……………………………………………………………………70
4.2.1清洗次數對於訊號/背景比的影響…………………………70
4.2.2不同濃度磁性微米粒子對Target DNA序列雜合效率的影
響……………………………………………………………72
4.2.3不同濃度奈米探針對Target DNA序列雜合效率的影響…74
4.2.4 DNA 探針選擇性探討.....................................................76
4.2.5同步偵測登革病毒第一型及第二型之可行性評估………..78
第五章 結論…………………………………………………………...81
第六章 參考文獻……………………………………………………...84

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