屋塵螨過敏原蛋白Der p 2於金針菇之異源表現

Study on expression of the house dust mite allergen Der p 2 in Flammulina velutipes

張家禎(Chia-Chang Chung)

指導教授 ： 黃慶璨

國立臺灣大學/生命科學院/微生物與生化學研究所/碩士(2006年)

https://doi.org/10.6342/NTU.2006.10222

摘要

塵螨是室內環境中常見的過敏原，其中源自於塵螨消化道上皮細胞的第二群過敏蛋白Dermatophagoides pteronyssinus 2（Der p 2）為導致氣喘等過敏症狀的過敏蛋白之ㄧ。台灣氣喘人口中有近百分之八十五對Der p 2過敏，其cDNA序列長度為387 bp，蛋白質由129個胺基酸組成，分子量約14 kD。
利用口服給予抗原蛋白，活化調節性T淋巴細胞，以降低抗原專一性的免疫反應，稱為口服耐受性（oral tolerance），此療法雖然便利有效，但卻受限於複雜的純化過程及昂貴之抗原蛋白。本研究嘗試以金針菇表現屋塵螨蛋白Der p 2，希望利用栽培技術成熟、方便安全可食用及低生態衝擊等優勢之菇類表達系統，開發口服減敏療法之新領域。
本研究分別以增加異源基因之5’端內含子、表現綠色螢光蛋白與der p 2融合基因、內質網停留訊號及慣用密碼子的更改等分生策略，建構表現質體，搭配電穿孔轉形方法進行金針菇菌絲體異源蛋白質之表達。
西方雜合分析顯示，以der p 2 cDNA所建構之表現質體於轉形後皆無明顯之Der p 2雜合訊號，未表現之轉形株以反轉錄-聚合酶連鎖反應確定mRNA正確存在，推測可能是異源基因轉譯層次的問題，進而根據金針菇最適密碼子變更der p 2為mder p 2，以mder p 2所建構表現質體之轉形株可由西方雜合分析可篩選到具Der p 2雜合訊號之菌株。接著由轉形株染色體DNA聚合酶連鎖反應及南方氏雜合分析，確定質體片段可經電穿孔轉形法插入轉形株染色體DNA中，具一至多個基因拷貝數。表現Der p 2之轉形株經三明治酵素免疫分析法（sandwich-ELISA）定量，其中轉形株pAImDS-19測得最高Der p 2表現量達可溶性蛋白之0.02%。
宿主的慣用密碼子或異源基因之G+C比例為金針菇表現系統中一相對重要之因子。在本研究中，利用金針菇表現屋塵螨蛋白Der p 2，不僅將菇類表現系統之蛋白質應用範疇向前推進，亦開創抗塵螨過敏食用疫苗之新型表現系統。

關鍵字

金針菇 ； Der p 2 ； 慣用密碼子 ； 內質網停留訊號

並列摘要

House dust mites are the most significant indoor allergens. Dermatophagoides pteronyssinus group 2 protein (Der p 2), originated from the digestive tract of host dust mites, plays a major role in induction of asthma, allergic rhinitis and allergic dermatitis. Up to 85% of asthma patients are sensitized to Der p 2 in Taiwan. There are 387 bp in the cDNA clone which encodes a 129-aa protein with a molecular mass of 14 kDa.
Oral tolerance can induce a group of antigen-specific regulatory T cells to suppress antigen-specific immune response through the oral administration of protein antigens presented by intestinal lymphoid tissue. However, the application of oral tolerance for the treatment of allergey was limited due to complicated purification and high cost of candidate allergens. To solve this problem, this study would like to develop the Der p 2-transgenic mushrooms possessing advantages of conveniently oral delivery and inexpensive protein production process.
In this study, four different strategies were used to improve the heterogenous gene expression in Flammulina velutipes. Plasmids with an intron at 5’ of der p 2, the endoplasmic reticulum retention signal HDEL at 3’ of der p 2, fusion gene of der p 2 and egfp (enhanced green fluorescent protein), and modified the codon of der p 2 (mder p 2) were constructed for F. velutipes. After transforming the target DNA to mycelium by eleporation, only transformants of mder p 2 with an obvious signal were observed in Western blot analysis. Using Der p 2 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (sandwich-ELISA), the transformant pAImDS-19 expressed the highest Der p 2 protein, c.a. 0.02% of the total soluble proteins. This study demonstrated the expression of mite allergen in mushroom and suggested that the codon usage or the G + C content are crucial for the expression of heterogenous protein in F. velutipes.

並列關鍵字

Flammulina velutipes ； Der p 2 ； codon usage ； endoplasmic reticulum retention signal

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