血球凝集素上的醣基調控 H6N1 禽流感病毒感染

The glycan of hemagglutinin regulates the H6N1 avian influenza virus infection.

何杰龍(Jie-Long He)

指導教授 ： 莊榮輝

共同指導教授 ： 王金和

國立臺灣大學/生命科學院/生化科技學系/博士(2013年)

https://doi.org/10.6342/NTU.2013.02628

摘要

本研究以病毒顆粒與合成胜肽為抗原進行小鼠免疫，生產專一性的單株抗體，並匯集成「禽流感病毒蛋白質體單株抗體庫」。我們已經篩選出一些單株抗體，可以辨識 H6N1 亞型 A/chicken/Taiwan/2838V/00 (2838V) 低病原性禽流感病毒的主要結構蛋白質，其中包括可專一性辨識 H6 亞型病毒血球凝集素次體 1 的單株抗體 (EB2 mAb)，被用於追蹤受 2838V 病毒感染細胞表面 HA1 以研究醣類對感染機制的交互作用。HA 活化切位 (HACS) 是決定禽流感病毒致病力的重要因子，低病原性禽流感在此活化切位上只有單一的鹼性胺基酸，僅能被 trypsin 給切開。但是除了活化切位外，HA1 上還有其他的切位可能被 trypsin 攻擊，這些切位如何抵抗 trypsin 的作用成為本研究關注的焦點。觀察切醣後經 trypsin 處理的病毒樣本，本研究發現 2838V 病毒 HA1 上的 N167 醣類可能保護 R201 切位抵抗 trypsin 切割。當這個醣類被切除，2838V HA1 便容易被 trypsin 切開。由細胞 in vitro 與雞胚蛋 in vivo 的實驗證實，2838V 同時切醣與外加 trypsin 會降低感染能力，這代表受 N167 醣類保護抵抗 trypsin 切割的 R201 切位附近的區域對於調控 2838V 病毒感染扮演重要角色。此外，本研究亦發現 EB2 單株抗體辨認 2838V HA 頭部接近受體結合區的抗原決定位。此抗體對於 H6 亞型病毒的中和能力已經流式細胞儀偵測感染細胞與雞胚蛋實驗確認。以 EB2 單株抗體辨認的抗原決定位序列合成的胜肽對小鼠進行免疫注射，小鼠抗血清具有與 EB2 單株抗體相似的中和反應能力。此抗原決定位可能具有臨床應用的價值，做為禽流感 HA 蛋白質結構與功能性研究的工具，甚至協助 HA 次單元疫苗的開發。

關鍵字

禽流感病毒 ； 單株抗體 ； 活化切割位 ； 醣類交互作用

並列摘要

In this study, a monoclonal antibody bank (mAb bank) against A/chicken/Taiwan/2838V/00 (2838V) virus was established by either the viron or synthetic peptides as the antigen. Several mAb against the major virion proteins of 2838V have been screened including a high specific hemagglutinin 1 subunit mAb (EB2) recognizing H6 subtype AIV. This mAb was used to trace the HA1 variation by infecting cells, and to investigate the glycan interaction in HA1. HACS is critical to viral pathogenicity. Low pathogenic AIV contains an HA cleavage site (HACS) having only one arginine or lysine which could be cleaved by trypsin. In addition, many cleavage sites excluding HACS are located in HA1. How the other cleavage sites resist trypsin digestion is our great interest. In the present study, our observations indicated that the glycosylation at N167 of the 2838V HA1 could protect R201 site from tryptic cleavage. The 2838V HA1 became sensitive to tryptic cleavage while the N167 glycans were removed. The infectivity of 2838V was also decreased upon pre-treated it with PNGase-F and trypsin in vitro and in vivo assay. Our observations suggest that the inaccessibility of the R201 residue of HA1 for tryptic cleavage, which is sterically hindered by glycosylation at N167, is an important factor in determining the infectivity of the 2838V AIV. Furthermore, we found that the EB2 mAb recognizes a linear HA epitope at the globular head near the receptor binding site of the 2838V. Flow cytometry of AIV-infected cells and embryonated eggs assay suggested that the neutralizing activity of this mAb for H6 AIVs. The mice injection with the EB2-defined epitope peptide showed similarly neutralizing activity to EB2 mAb. This epitope might be useful for clinical applications and as a tool for further study of the structure and function of the AIV HA protein, even subunit vaccine development.

並列關鍵字

Avian influenza virus ； monoclonal antibody ； HA cleavage site ； glycan interaction

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