瘤胃細菌Ruminococcus albus 7細菌素的半純化與特性分析

Semi-purification and characterization of bacteriocin from Ruminococcus albus 7

陳宜鴻(I-Hung Chen)

指導教授 ： 徐濟泰

國立臺灣大學/生物資源暨農學院/動物科學技術學研究所/碩士(2008年)

https://doi.org/10.6342/NTU.2008.02339

摘要

本試驗針對R. albus 7所分泌細菌素之半純化條件、特性與未來用於商業飼糧之可能性進行探討。R. albus 7細菌使用不含瘤胃液之化學培養基進行培養，參考文獻添3μM 3-phenylpropanoic acid與0.2% Tween 80當為刺激R. albus 7生長之刺激原，在連續培養下，從12至32小時的培養時間每6小時收取R. albus 7細菌素一次，尋找最適生產時間點，透過快速蛋白質分析儀（FPLC）以ion-exchange進行R. albus 7細菌素的半純化。特性分析則使用細菌素對Enterobacter aerogenes (BCRC 10370)、Salmonella enterica (BCRC 10747)、Pseudomonas aeruginosa (BCRC 10944)、Bacillus subtilis (BCRC 10029)及Staphylococcus aureus (BCRC 10451)等五種指標菌之抑菌效果。細菌素分子量的分析使用10% 原態電泳膠片（native-PAGE）抑菌活性測定方法估計，最小抑菌濃度則使用微劑量液態稀釋測定法（microtitre broth dilution method）進行測定，以飼料工業打粒常用溫度65℃，進行細菌素耐熱性檢驗，而在蛋白酶耐受性部分則使用胃蛋白酶（pepsin）、胰綜合酶（pancreatin）及商業蛋白酶（prokinase）等三種蛋白酶作用與比較，最終檢測使用1% bovine serum albumin為保護劑之效果。
試驗結果顯示R. albus 7能夠使用不含瘤胃液之培養基生產細菌素，且以培養時間24小時的細菌素抑菌總活性最佳，R. albus 7之未純化細菌素在初始試驗部分，即能展現最低64.5 % 最高80.5 % 的抑菌效果，後經5 kDa濃縮膜濃縮100倍，並使用FPLC配合DEAE管柱進行層析分離，在食鹽（NaCl）濃度0.23 M下，可獲得回收率達23 % 之半純化細菌素。使用原態膠體電泳進行活性分析結果顯示，R. albus 7細菌素應為33 kDa左右的蛋白質。經耐受性試驗測試，R. albus 7細菌素不能耐受pepsin、pancreatin、protease的水解作用或65℃之加熱處理，且進行家禽體外模擬消化試驗也顯示細菌素抑菌活力明顯下降74.7%以上（P < 0.05）。但當添加1% BSA為保護劑的情況下，則可減少抑菌活力下降比率達13%（P < 0.05）。在最小抑菌濃度測試中，R. albus 7細菌素若需達成50%抑菌濃度則至少需0.75 mg/mL，90%抑菌濃度則最少為6.5 mg/mL。培養基中添加刺激原3-phenylpropanoic acid（PPA）與Tween 80，可以使R. albus 7生長提早2小時達到高峰，同時使細菌素提早2小時產出，兩者共同添加更可以提早4小時產出，產量更可達到未添加時的2.5倍，其中又以有Tween 80添加的兩種處理均能獲得較好的抑菌效果（p < 0.05）。
綜合上述，R. albus 7細菌素具備對抗常見病原菌的能力，在考量其特性後，可添加保護劑以增其耐受力，應能擴展更廣泛的應用範圍，使R. albus 7細菌素成為一具有替代抗生素潛力之產品。

關鍵字

細菌素 ； 瘤胃細菌 ； 抗生素替代

並列摘要

Our research was set up to find more detailed characteristics of the bacteriocin from R. albus 7 and its potential as alternative of antibiotics. We also tried to establish reliable production and semi-purification procedures. In our results, R. albus 7 could be cultured in the medium without ruminal fluid to produce bacteriocin effectively against five pathogens (Enterobacter, Bacillus, Pseudomonas, Samonella, Staphylococcus). MIC50 and MIC90 of R. albus 7 bacteriocin were as low as 0.75 mg/mL and 6.5 mg/mL, respectively. The bacteriocin is highly released after 24 hr of incubation. Inclusion of 3μM 3-phenylpropanoic acid（PPA）and 0.2 % Tween 80 in culturing medium improved 2.5 times production of bacteriocin. Native-gel electrophoresis showed that bacteriocin of R. albus 7 had a molecular weight about 33 kDa. Semi-purification procedure resulted in 23% recovery rate of bacteriocin by using the DEAE column in FPLC system. The bacteriocin of R. albus 7 could be destroyed by pepsin, protease, and pancreatin. It also could be inactivated after heating at 65℃for 1 hr. Simulated in vitro avian digestion decreased the antagonistic activity by 74.7%. But, addition 1% BSA could retain 13% more antagonistic activity.
In conclusion, the bacteriocin of R. albus 7 is a heat-labile small protein. PPA and Tween 80 are recommended to be included in its production culture medium. DEAE column was suitable for its semi-purification. The bacteriocin of R. albus 7 has the chance as an antibiotic alternative with protectant added.

並列關鍵字

bacteriocin ； ruminal bacteria ； antibiotic alternative

參考文獻

王翰聰。2004。瘤胃細菌纖維及蛋白質分解酵素之生產與利用。國立台灣大學畜產所博士論文。1-156。

行政院農業委員會。2001。含藥物飼料添加物使用規範。行政院農業委員會。

葉娟美。2003。以gusA為報告基因探討Nisin調控表現系統於乳酸菌Lactobacillus

莊榮輝。2000。酵素化學實驗。國立台灣大學農業化學系。1-233.

Abee, T., L. Krockel, and C. Hill. 1995. Bacteriocins: mode of action and potentials in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol. 28: 169-185.