利用微孔二氧化鈦奈米線應用在子宮頸癌細胞中進行無標記定量磷酸化蛋白質體學分析

我們開發出一種具有高比表面積和孔洞一致性的二氧化鈦材料，以增加磷酸化胜肽的數量及再現性，再利用二氧化鈦奈米線和二氧化鈦微米粒子各別分析子宮頸癌細胞。其結果顯示，二氧化鈦奈米線相較於二氧化鈦微米粒子吸附能力約提高3倍，且二氧化鈦奈米線對磷酸化胜肽的選擇性高達（93.8%）相較於二氧化鈦微米粒子選擇性（71.8%），對磷酸化胜肽的選擇性提高了22%。二氧化鈦微米粒子平均總訊號強度為73,892,213，RSD：23%，而二氧化鈦奈米線平均總訊號強度為687,750,903，RSD：6%。二氧化鈦奈米線相較於二氧化鈦珠其平均總訊號強度提高了一個量級左右，且具有更好的磷酸化胜肽訊號再現性。基於這些結果，我們發現二氧化鈦奈米線對於應用在無標記定量（Label free）磷酸化蛋白質分析是具有良好之效果。二氧化鈦奈米線結合無標記定量可達到快速分析，且無需繁瑣的細胞標記，並可檢視細胞週期在不同階段時所造成的磷酸化變化。細胞週期階段分別有14000種以上的磷酸化發生，其中一半以上，就我們所知，還沒有被描述在文獻中。因此藉由定量技術的開發，將可有利於鑑定其調控有絲分裂的磷酸化蛋白質和磷酸化胜肽。其motif結果證明，利用二氧化鈦奈米線做為無標記定量相較於文獻中利用同位素標定(SILAC)方法，具有一致的定量結果，且我們額外看到一個獨特的圖案，表明還有至少一個未發現的有絲分裂激酶。結果證明，此新材料確實可運用於磷酸化蛋白質濃度之定量。

關鍵字

二氧化鈦奈米線；磷酸化胜肽有絲分裂；無標記定量；子宮頸癌細胞

並列摘要

Although isotope labeling approaches are widely used in quantitative phosphoproteomic analysis, there is a growing interest in developing label-free approaches due to their technological simplicity, and high dynamic range. However, successful analysis depends largely on the analytical reproducibility of sample preparation and chromatographic methods. We report here a novel affinity approach for efficient and reproducible isolation of phosphopeptides from complex peptide digests. The approach uses TiO2 nanowires with uniform pore structure and high effective surface area to improve the reproducibility of the phosphopeptide isolation. Compared with current TiO2-based isolation strategies using microparticles, TiO2 nanowires showed significantly improved reproducibility, selectivity, peptide-to-resin capacity, and phosphopeptide recovery from complex peptide mixtures. Application to 200 μg of unfractionated HeLa lysate digests using this new approach, we quantified 360 phosphopeptides (251 phosphoproteins) from double-thymidine arrested (G1 phase) cells and 300 phosphopeptides (218 phosphoproteins) from nocodazole arrested (Mitotic phase) cells.

並列關鍵字

TiO2 nanowire ； Phosphopeptide ； Mitosis ； Label free ； HeLa cell

參考文獻

1. Wasinger, V. C.; Cordwell, S. J.; Cerpa-Poljak, A.; Yan, J. X.; Gooley, A. A.; Wilkins, M. R.; Duncan, M. W.; Harris, R.; Williams, K. L.; Humphery-Smith, I. Electrophoresis 1995, 16, 1090-1094.