國立臺灣大學藥學研究所學位論文
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本論文研究華中五味子(Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils)之種子化學成分，從酒精萃取物中分離鑑定出七個新的木質酚素(1-7)和十一個已知化合物(8-18)。新發現的化合物schisphenin B (1)屬於 6,7-seco lignan、schisphentetralone A (2) 屬於aryltetralone-type lignan、schisphenins C-G (3-7)為 C18-dibenzocyclooctadiene lignans 。另外十一個已知化合物中有九個為木質酚素化合物，分別是 pre-gomisin (8)、meso-dihydroguaiaretic acid (9)、veraguensin (10)、(－)-8-epi-aristoligone (11)、benzoylgomisin P (12)、benzoylgomisin U (13)、gomisin F (14)、(+)-gomisin K3 (15)、schisantherin D (16) ，及兩個三萜類化合物 kadsuric acid (17) 和 coccinic acid (18)。 以上化合物的結構是利用核磁共振圖譜1D-NMR (1H-NMR、13C-NMR), 及 2D-NMR (COSY、HMQC、HMBC、NOESY) 及各種物理數據分析，包括旋光度、紅外線、紫外線、CD光譜及高解析電灑式質譜儀，並參考相關文獻而確認。立體結構方面，化合物3-7 的biphenyl moiety部分為S-configuration且cyclooctadiene ring部分均為twist-boat-chair (TBC)構型。 最後將所分得的十八個化合物進行生物活性檢測，利用reporter gene assay測試抗肝纖維化活性，發現化合物1、2、4、11、13、14、18對大鼠肝纖維化細胞有抑制作用，其中以化合物11效果最強。另外抗氧化試驗中發現化合物9有不錯自由基捕捉能力，但仍較vitamin C差。
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第二型鈉離子依賴型轉運蛋白 (sodium-dependent glucose transporter-2，SGLT2) 抑制劑被認為具有調控血糖的功能，而利用結構與活性關係的探討，可了解最適合之抑制劑結構。本研究嘗試利用不同結構之糖苷類化合物，分別探討其糖基及非糖基結構對鈉離子依賴型轉運蛋白功能之影響。其轉運功能利用大鼠腎臟及小腸刷狀外緣細胞膜微粒配合放射性物質及快速過濾技術來測定。同時，為評估抑制劑是否可發展為有效之口服降血糖藥物，以人類肝臟微粒體系統檢視其代謝狀況，並利用大鼠之原位小腸灌流試驗評估其腸道穿透性，配合溶解度試驗進行生物藥劑學分類，以了解其腸道吸收之特性。 研究結果顯示，非糖基之芳香環需與糖基呈一定距離且具有適當之取代基以達到選擇性抑制第二型鈉離子依賴型轉運蛋白之作用。此外，糖基結構與鈉離子依賴型轉運蛋白的交互作用對其抑制效果是必要的，而將dapagliflozin 之糖基修改為五元環之新化合物core 1 亦具有抑制腎臟刷狀外緣細胞膜微粒轉運葡萄糖的功能，兩者IC50 分別是19.2 ± 7.1 (μM) 及9.0 ± 3.7 (μM)。Core 1 與dapagliflozin 同樣可能經由phase II 代謝酵素作用而降解，而推算其人體腸道吸收分率約為90 %，顯示在口服吸收的過程中可能會受到腸道穿透性不佳的限制。由以上藥效及藥動學之探討，本研究提供第二型鈉離子依賴型轉運蛋白抑制劑之結構特性，並討論發展為口服降血糖藥物必要的考量，可作為此類藥物後續研究方向之參考。
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21世紀，隨著環境及生活習性的改變，「三高」成了現代人的文明病，其中的高血糖則是和糖尿病 (Diabetes Mellitus) 息息相關，已成為世界各地廣泛盛行的一種慢性病，使用藥物治療對於糖尿病達到理想血糖控制是必要的，雖然目前市面上已有多種口服降血糖用藥可供選擇，但都有其相對的禁忌及副作用，因此新藥的開發仍有相當需求。 α-glucosidase inhibitor (AGH) 藥物的作用機轉為抑制在小腸刷狀緣上的甲型葡萄糖水解酶，進而減少碳水化合物的代謝，而減少葡萄糖之產生與吸收，可改善飯後高血糖的情形。根據文獻報導，松醇 (D-pinitol) 具有擬胰島素作用而可增加細胞對葡萄糖的吸收，本實驗設計，即希望以松醇為起始物進行結構修飾，得到類似Miglitol或是Voglibose架構之化合物並測試其活性，首先將松醇第四位置之羥基經四步反應轉換為胺基，接著在氮上進行不同的醯烷化反應，所得產物大致可分成三個系列，(1) 直接性的烷基化 (化合物23~26) (2) 醯化反應 (化合物27~30) (3) 還原性胺化反應 (化合物 31~34)，將所得化合物進行甲型葡萄糖水解酶活性測試，結果抑制活性皆不佳，將進行後續相關之glucose transporter assay。 本實驗之另一部分為利用化學反應方法改善分離之不便，由鵝不食草中分離出的主要成分之主架構為倍半萜環酯類 (sesquiterpene lactones) 中的pseudoguaianolide，被認為具有細胞毒殺性，而在支鏈上有不同的碳數取代，也因結構的極性相似度高造成分離上的繁瑣及困難，利用水解方式切除酯鍵保留原主架構，以供後續相關的衍生化產物之製備。
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ANKS1B表現於成人的大腦與睪丸組織中，目前被認為可能與細胞內蛋白質的生成有關。因ANKS1B與第一型穿膜蛋白APP有交互作用，故ANKS1B又被稱為AIDA-1。過去的研究指出若以NMDA刺激會促使ANKS1B產生斷裂，而後N端片段移動至細胞核內而C端片段則留在細胞質中。在這裡我們想釐清APP processing是否影響ANKS1B進入細胞核。我們發現當使用DAPT處理SH-SY5Y抑制AICD從APP釋放時，NMDA刺激造成的ANKS1B進核現象會受到抑制。但是當在細胞內表現失去PTB domain與C端末端的ANKS1B時，則其不需經NMDA刺激即可進入細胞核中。當在細胞中大量表現含YENPTY序列的AICD，使其與膜上APP競爭與ANKS1B的交互作用，發現ANKS1B不需經NMDA刺激，即可進入核內。這些結果指出膜上APP對ANKS1B可能扮演anchor的角色。同時觀察到在大量表現AICD競爭時，進入核中的同樣只有N端的ANKS1B片段，我們因此假設APP對ANKS1B可能也具有保護的作用，當ANKS1B失去與APP除AICD外的其他部分的交互作用時，會使ANKS1B被細胞內某一種蛋白酶切割，而後產生的N端片段得以進入細胞核中。我們發現在NMDA刺激與大量表現free AICD時都會導致細胞內鈣離子濃度上升，在利用CaMPDB計算受鈣離子活化的蛋白酶calpains在ANKS1B上可能的作用位置後，發現若在第283個胺基酸後產生交互作用則產生出來的斷裂片段大小與受NMDA刺激產生出的片段大小相似，懷疑其可能為對ANKS1B作用的蛋白酶，目前的實驗結果顯示在NMDA刺激造成ANKS1B斷裂的條件下，未觀察到calpain活化態的產生。根據這些結果， APP在ANKS1B的進核現象中扮演著重要的角色，彼此的交互作用可能影響ANKS1B在細胞內的功能。
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一般認為慢性發炎為癌症的傾向因子，但連結的精確機制則有待釐清。 CX9051為本實驗室確認之環氧酶-2（COX-2）及5-脂氧合酶（5-LOX）雙重抑制劑的苯駢[1.3.2]-1,1-雙氧雙噻唑偶極體衍生物，且顯示有抗發炎及抑制癌細胞增生的活性。本論文的結果證實，CX9051可以抑制脂多醣（LPS）引起的前列腺素E2 （PGE2）及腫瘤壞死因子α （TNF-α）生成，且可降低COX-2、iNOS、Akt及NF-κB蛋白質表現量及NF-κB核內外轉移。另外，CX9051可抑制前列腺癌細胞株的增生及誘發細胞凋亡，此效果被證實為是經由調控NF-κB腫瘤壞死因子及增加腫瘤相關細胞凋亡誘導配體（TRAIL）的過度表現，並活化可與粒線體引起的內在凋亡途徑有交互作用的外在凋亡訊息，進而造成癌細胞產生細胞凋亡反應。本研究中所證實CX9051具有抑制增生及抗發炎活性之結果，證明CX9051可作為抗發炎及化學預防抗癌的前導化合物。另外，此論文研究利用結構修飾原理設計一類新穎的第一型拓樸異構酶（Top I）抑制劑，其中最有效的Top I抑制劑，化合物26，為喹啉-4-酮衍生物，藉由降低Top I蛋白質表現及引起DNA單股斷裂，造成Top I毒性引起的細胞毒殺效果，進而對大腸腫瘤誘發老鼠模式也具有治療性的抗腫瘤活性效果。根據化合物26所表現的抑制Top I活性及在HT-29細胞株中誘發細胞凋亡及抑制腫瘤誘發活性等結果，提供另一前導化合物可用於發展新穎的Top I抑制劑來治療癌症。總之，本論文研究結果顯示苯駢[1.3.2]-1,1-雙氧雙噻唑偶極體及喹啉-4-酮衍生物可分別作為發展抗發炎及抗癌藥物發展的先導化合物。
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為了發展出強效的細胞週期抑制劑，本論文將以E7010為起始模板進行結構修飾。根據固定構型設計概念，E7010中連接兩芳香環之可旋轉的二級胺鍵結將被固定。根據此設計構想合成了一系列1,4-二甲基咔唑苯磺醯胺衍生物。生物活性測試結果顯示，化合物18a展現強效的抑癌效果，其對於HeLa、HT-29及Hep3B腫瘤細胞呈現GI50為0.02至0.07 µM的卓越抑制活性。另外，咔唑苯磺醯胺衍生物26b亦呈現良好的抑癌活性，其對於A549腫瘤細胞呈現GI50為0.08 µM的抑制活性。磺醯胺結構上取代甲基及乙基之化合物22a及23a不僅保持強效之生物活性，對於AGS及PC-3腫瘤細胞，甚至呈現更有效的抑制活性。 由於橢圆玫瑰樹鹼之四環平面結構包含1,4-二甲基咔唑特徵，為了提高苯磺醯胺衍生物18a之抗癌活性，本論文將化合物18a之1,4-二甲基咔唑置換成橢圆玫瑰樹鹼，合成了一系列橢圆玫瑰樹鹼苯磺醯胺衍生物30。雖然其生物活性測試結果並未呈現強效的癌細胞抑制活性，但是橢圆玫瑰樹鹼第7位卻是值得繼續探索並發展更有效的腫瘤細胞抑制劑。 欲求提高Saxton合成橢圆玫瑰樹鹼全合成之產率，本論文運用微波於橢圆玫瑰樹鹼之全合成。透過單槽式合法法合成二級胺化合物47，可以有效地降低反應時間並提高合成產率，全合成總產率提升約10倍。為求更高反應產率，較低產率的D環環化步驟，因為二級胺結構轉化成甲基苯磺胺結構56後，大大地提升其環化產率至75%，全合成總產率提升約25倍。為了將微波廣泛地運用於橢圆玫瑰樹鹼衍生物合成中，微波亦應用於9-溴化橢圆玫瑰樹鹼及9-硝基橢圆玫瑰樹鹼合成中，皆能獲得良好的反應產率。
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本實驗室在之前的研究發現1-（4-溴苯甲基）-4-（3-氯苯基）-7-甲氧基喹唑啉酮（24）對第四與第五型磷酸二酯酶具雙效抑制劑的表現，為了深入探討第四與第五型磷酸二酯酶雙效抑制的結構與活性關係研究以化合物24作為先導化合物並合成一系列4-芳香基-1-苯甲基喹唑啉酮衍生物。在這些目標化合物的合成策略中，4-芳香基-喹唑啉酮衍生物經由化合物35與鎂反應生成的格里納試劑與化合物30與31進行合環反應得到。目標化合物經由4-芳香基-喹唑啉酮衍生物與4-溴苯基溴進行縮合反應得到。 在這些目標化合物中，化合物37b、37c、37e與37j展現比化合物24更卓越的磷酸二酯酶雙效性抑制效果。根據結構與活性關係研究的分析，在喹唑啉酮第四位置上芳香基的第三與第四位置獲得官能基的特徵包含小的結構立體效應、強大的推電子基與扮演氫鍵提供者明顯地增強對磷酸二酯酶雙效性能力與其他磷酸二酯酶的選擇性。此外，在探索喹唑啉酮的第1位置取代基對於雙效型抑制劑的結果中，官能基的脂溶性有著有利的影響對於第五型磷酸二酯酶的抑制能力與對其他磷酸二酯酶的選擇性。 此外，在化合物37b與37c的主結構喹唑啉酮第六位置接上一個溴原子進行修飾所合成之化合物48b與48a，化合物48b與48a出人意料地增強了對於抑制第五型磷酸二酯酶並且展現對於其他磷酸二酯酶卓越的選擇性在臨床上與目前知名的第五型磷酸二酯酶抑制劑相較之下。 其他的新穎化合物1-（4-溴苯甲基）-4-（3-氯苯基）-3-（2-羥乙基）-7-甲氧基喹啉酮（26），經由多個步驟合成包含酸水解經由格里納試劑與化合物30反應產生的中間體得到化合物49、化合物49與4-溴苯醛進行亞胺還原反應產生化合物50與化合物50與γ-丁內酯經由克諾維納蓋爾縮合反應的環化反應獲得化合物26。結果顯示化合物26展現強效抑制對於第四型與第五型磷酸二酯酶而且對於第七型磷酸二酯酶具附加抑制效果。因此，化合物26是被認為具潛力的先導化合物進行更進一步的最佳化修飾在發展第四型、第五型與第七型磷酸二酯酶抑制劑。
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安定性對藥物產品是否能成功開發具有指標性的作用，如果藥物受到降解，它不只會使療效下降，可能還會生成有害的降解產物。因此對藥物安定性、降解的機制及模式等研究日受重視。在本研究中，以蘭索拉唑(Lansoprazole)為一模式藥物，對其安定性進行研究。此外，利用生分解性材料製備可緩釋藥物的微球載體，是近年來廣泛被研究的主題，本實驗選用生分解性聚合物聚己內酯(Poly-ε-caprolactone, PCL)作為包覆藥物的材料，利用熔融包覆法製作微球，可避免有機溶劑的使用。 實驗中對蘭索拉唑安定性的研究分成兩個部份，分別是以聚乙二醇300及聚乙烯醇水溶液為外相，於70℃加熱觀察藥物經時變化。若以聚乙二醇300為外相，則探討蘭索拉唑/聚乙二醇300重量比及聚己內酯對蘭索拉唑的影響；而以聚乙烯醇水溶液為外相，則探討蘭索拉唑在聚己內酯、聚乙烯醇水溶液、聚己內酯+聚乙烯醇水溶液中的安定性。接著利用熔融包覆法將蘭索拉唑包覆於聚己內酯微球中，並控制製作過程中聚乙烯醇濃度、藥物/聚合物重量比及超音波打碎時間等變因，對微球進行評估。 實驗結果顯示，不同蘭索拉唑/聚乙二醇300重量比，於70℃的藥物降解速率為1/1000組別 > 10/1000組別 > 100/1000組別，其降解最適合以零階動力模式描述；相較於聚己內酯，蘭索拉唑較易存留在聚乙二醇300中，且安定性也較在聚己內酯中佳。蘭索拉唑在聚己內酯及聚乙烯醇水溶液不同組合下，於70℃的藥物降解速率為(蘭索拉唑+聚己內酯+聚乙烯醇)組別 > (蘭索拉唑+聚己內酯)組別 > (蘭索拉唑+聚乙烯醇)組別 > 蘭索拉唑組別，其降解最適合以一階動力模式描述。在HPLC層析圖譜中最多可觀察到6個降解物生成，以RT (Retention time)13.3分鐘降解物生成最快且最多。 在蘭索拉唑-聚己內酯微球的研究方面，以熔融包覆法所製得微球產率皆有80%以上；藥品包覆率及藥品含量會隨著藥物/聚合物重量比的增加而增加，但隨著超音波打碎時間的增加而減少；在SEM觀察下，可看到微球具有球狀外觀，唯表面較為粗糙，微球粒徑分佈寬廣顆粒大小摻雜。經FT-IR及DSC分析可知，蘭索拉唑是以物理性包覆於聚己內酯，且其結晶度會受聚己內酯的影響。在體外溶離試驗中，經f1值與f2值分析可得知，聚乙烯醇濃度及藥物/聚合物重量比對微球的釋離結果並無明顯差別；而以超音波打碎時間3分鐘的藥物釋離速度及累積釋離量明顯最快且最高。在腸衣包覆試驗結果顯示，聚己內酯微球有減緩酸降解蘭索拉唑的能力，而經腸衣包覆之微球膠囊則可完全保護蘭索拉唑免於被酸降解，且藥物釋離結果不受影響。 在大鼠體內藥物動力學的結果顯示，相較於靜脈注射蘭索拉唑溶液，口服微球的半衰期(T1/2)及平均滯留時間(MRT)較長，因此可延長藥物的作用時間。唯微球的生體可用率僅3.4%，顯示此微球劑型要應用於活體內，需再包覆一層腸溶膜衣。
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前列腺癌一直是西方國家高罹患率及高死亡率的癌症之一，而隨著生活習慣及飲食的西化，前列腺癌的罹患率及死亡率也在亞洲地區快速的攀升。造成前列腺癌高死亡率的主要原因來自於癌症的轉移及惡化，但目前並沒有有效治療的藥物，極需要相關研究的投入。本次研究之化合物WJ9708012 (6-(3-Hydroxy-3-methylbutyl)-2’-(7-hydroxy-3,7-dimethyloctyl)-3’,4’,5,7-Tetramethoxy -flavanone) 為類黃酮類結構，與一般類黃酮類化合物不同，其不具有強效的抗氧化能力，但對於人類賀爾蒙抗性前列腺癌細胞PC-3及DU-145，則展現抑制細胞生長及促進細胞凋亡之能力。於抑制細胞生長功能上，WJ9708012藉由抑制mTOR相關訊息傳遞路徑，使cyclin D1等G1細胞週期調控之重要分子表現量降低，造成G1細胞週期停滯現象。使用西方點墨法觀察發現，WJ9708012造成p-mTORser2448、p-P70S6KThr389及p-4E-BP1Thr37/46位置的磷酸化現象明顯減少，使eIF4E調控的7-methylguanosine 5’-triphosphate (m7GTP) cap-dependent translation無法進行，下游cyclin D1等G1細胞週期相關蛋白在mRNA沒有明顯減少的情況下蛋白表現量皆大幅降低，使細胞無法順利通過G1細胞週期，產生停滯生長現象。此現象可藉由給予胎牛血清使mTOR相關訊息傳遞路徑活化的方式降低，間接證明抑制mTOR相關訊息傳遞在此化合物抑制細胞生長之功能中扮演重要角色。在引起細胞凋亡方面，短時間處理WJ9708012可產生一個由細胞外進入胞內的鈣離子流，造成胞內鈣離子濃度迅速上升並活化鈣離子相關訊息分子，如：μ-calpain、PKC-α及calmodulin，使細胞內粒線體及內質網兩個調控鈣離子之重要胞器產生壓力或傷害等影響。粒線體部分，WJ9708012造成粒線體損傷，使膜電位流失及下游內生性細胞凋亡訊息途徑啟動。以西方點墨法觀察，可發現化合物造成粒線體凋亡因子釋出、caspase-9、-3、-7活化及晚期Bcl-2家族蛋白表現量改變及斷裂現象。另外，化合物也會造成細胞內能量恆定失調，使在此扮演細胞保護功能之AMPK蛋白活化，調控下游訊息分子。於內質網部分，則可觀察到內質網壓力產生，使GRP78、GADD153及Caspase12表現量增加或斷裂活化的現象。WJ9708012引起的粒線體損傷和內質網壓力在密切的訊息傳遞後，會造成細胞凋亡途徑的啟動。使用流式細胞儀可觀察到subG1細胞增加和具有PI-Annexin X雙重螢光訊號細胞增加的現象。此外，使用TUNEL assay亦可觀察到具有DNA斷點的螢光訊號之細胞增加情形。總體而言，WJ9708012引起人類賀爾蒙抗性前列腺癌細胞PC-3細胞G1細胞週期停滯及細胞凋亡反應，主要是藉由抑制mTOR相關訊息傳遞路徑及引起鈣離子流入細胞質，影響相關訊息傳遞分子之活性，並造成粒線體及內質網損傷，而啟動細胞凋亡途徑來達成。
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根據本實驗室先前對一系列氟化胺基蒽醌類化合物的藥理活性篩選結果，選定研究合成氟-十八標記之化合物48以應用於正子斷層掃描；合成原則是將導入氟-十八的反應盡量安排至整個合成路徑的末端，並且最佳化整體反應所需要的時間，使氟-十八之放射損失減至最小，理論上可將氟-十八經由直接親核取代導入前驅物2，或間接的利用氟-十八取代之輔基的方式分別導入前驅物1來得到氟-十八標記之目標化合物48；本論文成功合成可應用之前驅物1 (49)及2 (39)，氟化標準品38及48；首先，將買來之N-(3-羥丙基)乙二胺側鏈末端之羥基利用TBDMS保護基保護，進行氧化縮合反應接至Leucoquinizarin上，接著胺基(R1和R3)用三苯基甲基保護基保護，再利用氟化鉀和Kryptofix 222將羥基上之TBDMS保護基移去，進行甲磺醯化反應(Mesylation)可得前驅物39；此外，將買來之乙二胺用Teoc保護基保護後，一樣進行氧化縮合反應接至Leucoquinizarin上，接著胺基(R1)用三苯基甲基保護基保護，再利用氟化鉀和Kryptofix 222將羥基上之Teoc保護基移去，得到前驅物49，接著前驅物49和和輔基，3-氟丙基對甲苯磺酸，做親核取代反應，可得氟化標準品48，產率為26%；最後將三苯基甲基保護基保護標準品48的胺基，可得氟化標準品38。