國立臺灣大學藥學研究所學位論文
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從海棉中萃取出的醣脂質化合物— α-Galactosylceramide (α-GalCer)，在in vivo與in vitro研究顯示其具有抗腫瘤活性。這種醣脂質與抗原呈現細胞上的CD1d蛋白結合後，形成CD1d/醣脂質/自然殺手T細胞複合體，而刺激自然殺手T細胞產生Th1 細胞激素和Th2細胞激素。在醯基鏈或醣基之C6”有芳香基取代之α-GalCer衍生物，有較佳之刺激Th1細胞激素分泌之選擇性。目前尚未有科學家研究這兩類化合物芳香基上之取代的結構與活性關係，因此，根據Topliss方法，我們設計苯基取代的癸醯基鏈類似物，使用A20CD1d 和mNK1.2系統測試其對IL-2分泌之刺激，結果顯示這類癸醯基鏈苯基取代基的化合物具有與α-GalCer相當之活性。我們在C6”位置上以苯基醯胺取代，發現碳鏈長度最短之苯基乙醯胺取代的87在87 - 89當中最有活性。因此，我們進一步合成C6”和醯基鏈雙苯基取代之化合物，其中在C6”之苯基有推電子取代之94, 98和100，相較於α-GalCer的免疫刺激活性略為增加。另外，我們合成醯基鏈有雙羥基之化合物，為增加化合物之水溶性，活性測試顯示其活性與α-GalCer相當。 目前最有活性之α-GalCer類似物C34，被選為進入前臨床及臨床試驗之抗癌藥物。為了藥物化學之研究，文獻中僅有小量之醣脂質合成方法，但大量的製程研究還未被報導過。為此，我們開發大量的C34製程，以phytosphingosine HCl為起始物，經由八個化學反應，總產率為14%。關鍵的醣化反應，我們選擇 thioglycoside做為供給者以Me2S2-Tf2O在溫和的條件下反應，較適合於工業上之應用。經過反應條件之最佳化，我們能夠在實驗室操作50克之批次。
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精神分裂症是當前最嚴重的精神疾病之一，好發於青少年晚期或成人初期。傳統上治療精神分裂症的藥物為典型抗精神病藥物，利用阻斷多巴胺第二型接受器達到抗精神病之作用，但是會引起錐體外症狀。後來發展出非典型抗精神病藥物，為血清素二A亞型接受器拮抗劑，並且對於多巴胺第二型接受器親和力低。本實驗室先前以酮色林為先驅化合物合成2,3-dihydroimidazo[1,2-c]quinazolin-5(6H)-one化合物，為血清素第二A型接受器拮抗劑，本研究以化合物15為先導化合物，p-fluorobenzoyl側鏈以環封閉設計等效異構物benzisoxazole官能基，與2,3-dihydroimidazo[1,2-c]quinazolin-5(6H)-one縮合。此系列化合物具有血清素二A亞型接受器拮抗劑活性，並且達subnanomolar等級，在動物實驗之前脈衝抑制反射測試也發現氯、甲基以及甲氧基修飾之化合物具有改善精神分裂症的效果。
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轉移性荷爾蒙不依賴型前列腺癌是此癌症的主要死因，所以藥物研發多著重於此。許多抗癌療法的目的，大多是要抑制癌細胞生長或引起細胞凋亡。因此本篇論文以轉移性荷爾蒙不依賴型前列腺癌細胞株PC-3細胞為主，探討了數種具有抑制細胞生長及細胞凋亡的化合物的機轉。 第一個部份我們探討了海洋海綿代謝物ilimaquinone的抑制生長作用。Ilimaquinone對於許多癌細胞株，如前列腺癌細胞PC-3及LNCaP 、非小細胞型肺癌細胞A549及肝癌細胞Hep3B有生長抑制的作用。從流式細胞儀分析細胞週期發現ilimaquinone增加G1期細胞的比例及cyclin E的表現與細胞核的分布，顯示細胞週期停滯於G1/S期。我們的研究排除了ilimaquinone對高基氏體囊泡化及抑制NF-κB的活性和生長抑制作用的關係。同時我們也發現ilimaquinone增加CHOP/GADD153 (growth arrest- and DNA damage-inducible gene 153) 的表現及細胞核的分布。進一步的研究發現CHOP/GADD153的antisense可以明顯減少ilimaquinone所引起的細胞生長抑制，顯示CHOP/GADD153對於生長抑制的重要性。總結以上結果，我們發現ilimaquinone使細胞週期停滯在G1期並且增加CHOP/GADD153的表現及核轉移來達到生長抑制的作用。 接下來，第二部份我們探討G2/M期停滯對於癌細胞生長抑制作用的影響。以小分子化合物K2154 [ethyl-2-[N-ρ-chlorobenzyl-(2′-methoxy)]-anilino-4-oxo-4,5-dihydro-furan-3-carboxylate]作為機轉探討的主角，並且比較其與taxol及vincristine的異同。K2154對於PC-3、Hep3B、A549、HT-29及HCT-116及對taxol與vincristine有抗藥性的NCI/ADR-RES細胞有生長抑制的作用。由流式細胞儀分析發現，K2154使細胞週期停滯在G2/M期，並且伴隨sub-G1期的增加，但是這個現象在正常的前列腺細胞並未被觀察到。在in vitro turbidity assay及in vivo microtubule spin-down assay顯示K2154可以抑制微小管的聚合，並且從免疫螢光染色的實驗可知，K2154會影響紡錘體的形成，並且對於betaII及betaIII微管蛋白的作用特別明顯。從西方墨點法得知K2154增加Cdk1的活性，並且其抑制劑roscovitine可以減少K2154所造成的sub-G1細胞增加，顯示Cdk1在K2154引起的細胞凋亡扮演重要的角色。另外K2154引起Bcl-2及Bcl-xL的磷酸化、Mcl-1的裂解、caspase-9和caspase-3的活化及AIF(apoptosis-inducing factor)的釋放作用，顯示粒線體參與細胞凋亡的過程。綜合以上結果，K2154可作用在微小管並且接著引起有絲分裂停滯及細胞凋亡的訊息來達到其抗癌活性。 雖然在第一部分我們證明了高基氏體在ilimaquinone的抗癌作用中並非扮演重要的角色，但是卻引起我們想要探討此胞器是否與粒線體及內質網同樣參與細胞凋亡過程的興趣。由於高基氏體的形態受到微小管動態平衡的影響以及在有絲分裂的過程中會產生碎裂，因此第三部份我們使用taxol來探討高基氏體在細胞凋亡過程中所扮演的角色。我們發現taxol會讓高基氏體產生碎裂，而這些碎片在細胞內的分布有靠近粒線體的情形。另外，taxol也會活化高基氏體上的caspase-8和caspase-3及增加δCF(catalytic fragment of PKCδ）的表現，顯示高基氏體參與細胞凋亡的過程。由西方墨點法結果得知taxol會增加高基氏體的Cdk1的活性，而且Cdk1抑制劑roscovitine可以抑制高基氏體上caspase-8和caspase-3的活化及δCF的增加，顯示高基氏體的Cdk1扮演細胞凋亡因子的角色。此外，我們也發現PKCδ抑制劑rottlerin可以抑制taxol所引起的細胞凋亡及高基氏體Cdk1的活性，顯示PKCδ為活化Cdk1的上游因子。然而PKCδ在高基氏體上的活性是減少的，進一步的結果顯示PKCδ在細胞質內並無活化的現象，在細胞核內短時間有顯著活化的情形，因此推測高基氏體Cdk1的活性增加可能來自於細胞核內PKCδ活化的結果。綜合以上結果，我們發現PKCδ及其下游高基氏體Cdk1的活化，參與taxol所造成的細胞凋亡。
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血清素受體均為穿膜蛋白，主要分佈在神經細胞上，分為七科，十四種亞型。除第三種亞型以外均隸屬 G 蛋白偶合受體（G Protein-coupled receptor, GPCR）。其訊息傳遞路徑在生理上具調控情緒、幻覺、記憶、橫紋肌收縮與飽食感等功能，也成為許多藥物分子的作用目標，臨床上已有抗精神病、抗憂鬱與偏頭痛藥物等應用。但多數血清素受體藥物以高度不具專一性著稱，副作用無法避免。而開發新藥時除了須讓藥物有能力辨識血清素受體與其他種類的 GPCRs ，受體亞型的選擇性（subtype selectivity）更是個尚待解決的議題。 不同受體與配體之間交互作用的差異，最好能由結構生物學探討其分子機制，即基於結構設計藥物（structure-based drug design）。然而，穿膜蛋白厭水與結構易變動的特性使其結晶困難，此類蛋白結構的解析仍為一大挑戰。目前實驗上尚未解得任何一種血清素受體結構，所幸近年陸續解出的數種 GPCRs 提供了電腦模擬的模板。在本論文中，將現存人類 GPCR 資料庫中 A 族群的所有序列與可得的結構模板，經多重序列比對結果引導，以現有視紫質蛋白（rhodopsin）與 β2 腎上腺素受體（β2-adrenergic receptor）為主要模版骨架，建構了 2A、2B、2C 與 4 至 7 等七種血清素受體亞型，以及補全缺失片段後的 β2 腎上腺素受體（作為控制組）之同源蛋白模型（homology/de novo models）。將這些初始蛋白模型埋入脂雙層膜--水系統中，運行奈秒時間尺度的分子動力模擬，探索穿膜蛋白在生理狀態下的未活化態結構。配體分子挑選實驗上具代表意義的選擇性抑制藥物，以量子化學執行結構最佳化後，參考模板結構，運用分子嵌合技術（molecular docking）預測藥物嵌入血清素受體的結合位置。 本論文挑選 5-HT7 與 5-HT2A 兩種受體亞型作為研究主體。在藥物的結合模式評估上，進行藥物受體複合物的分子動力學模擬，直接分析抑制性藥物在蛋白質受體內的運動結果。藉分析胺基酸與小分子官能基之間的交互作用差異，蛋白結合位置的大小與藥物分子佔據體積，可望在亞型選擇性的問題上做出分子層級上的解釋。此套模型建立的流程已半自動化，可望發展為一種相較於簡單評分函數更具物理意義的平台。日後可繼續拓展至其他血清素受體亞型，且進一步衍伸至親緣性相近的其他 GPCR 蛋白，如多巴胺受體（dopamine receptors）與鴉片受體（opioid receptors）等重要的藥物標靶之上。
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肝素結合凝血附著素（heparin-binding haemagglutinin adhesin，HBHA）的c-terminal區域已被認為是主掌HBHA蛋白與宿主肺部細胞附著作用的主要區段，此c-terminal區域主要含lysine（K）、alanine（A）、proline（P）三種胺基酸，且由KKAAPA（R1）和KKAAAKK（R2）這兩段片段重複排列而成。過去本實驗室將R1、R2這兩種片段依不同組合合成出六段胜肽：HBHAa （3R1）、HBHAb（3R1+1R2）、HBHAc（1R1+2R2）、HBHAd（2R1+2R2）、HBHAe（2R2）和全長HBHA的c-terminal區域（3R1+2R2），以人類肺部上皮癌細胞（A549）與人類結腸腺癌細胞（Caco-2）作為研究穿胞運送的模式細胞。結果顯示HBHAc 為具有結合、攝取及穿胞能力之最短HBHA相關胜肽序列。在本研究中，使用cytochrome c（Cyt c）及基因重組精胺酸去亞胺酶（recombinant arginine deiminase，rADI）其分子量分別是12 kDa及92 kDa當作模式蛋白質，以化學鍵結的方式或是分生技術，研究HBHAc運送不同大小蛋白質的能力，進一步探究不同的鍵結方法對於運送的效果是否有不同的影響。 首先將HBHAc標記上FITC螢光分子，從共軛焦螢光影像發現，投予HBHAc一小時後，HBHAc進入細胞內且分布於細胞質及細胞核中。Cyt c為細胞凋亡中的一個重要中間者，從粒線體釋出至細胞質中的Cyt c 會誘發細胞的凋亡反應。我們利用SPDP及Sulfo-SMPB linker以化學鍵結的方式將Cyt c和HBHAc以可還原的雙硫鍵及不可還原的硫醚鍵連接在一起，並純化之。投予Cyt c-HBHAc conjugates一小時後，共軛焦螢光影像發現兩種Cyt c-HBHAc conjugates不僅分布於細胞質也在細胞核中；在生物活性方面，兩種Cyt c-HBHAc conjugates皆顯著地抑制A549、MCF-7、Caco-2的細胞存活率，且兩種Cyt c-HBHAc conjugates彼此間無顯著差異。然而， 使用流式細胞儀配合Propidium iodide 評估細胞凋亡現象， Cytc-SPDP-HBHAc conjugates對於細胞週期並無顯著的影響。 另一方面，使用分子量較大的rADI 當作模式蛋白，rADI 可將精胺酸（Arginine）反應成瓜胺酸（Citrulline）和胺（ammonia），被認為是有潛力的抗癌藥物。使用分生技術製備HBHAc-rADI 質體，並用管柱純化此融合蛋白，MTT 發現HBHAc-rADI 融合蛋白相較於rADI 單獨投予，顯著地抑制MCF-7 的細胞生長；在單劑量或多劑量模式的比較中，多劑量投予HBHAc-rADI 融合蛋白比單劑量投予更明顯地抑制細胞生長。使用Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）評估HBHAc-rADI 融合蛋白對於精胺酸和瓜胺酸含量的影響。投予10 mU/mL rADI或HBHAc-rADI 融合蛋白四天後，rADI 與HBHAc-rADI 融合蛋白皆使得細胞外的精胺酸下降，瓜胺酸增加，兩者間無顯著差異；控制組、rADI、HBHAc-rADI 融合蛋白投予下的細胞內精胺酸含量彼此間皆無顯著差異；但細胞內的瓜胺酸在HBHAc-rADI 融合蛋白投予下顯著地高於rADI 單獨投予（p＜0.05）；以細胞內瓜胺酸與精胺酸的比值（citrulline/arginine）來看，HBHAc-rADI 融合蛋白投予下顯著地高於rADI（p＜0.01）及控制組（p＜0.01），但單獨投予rADI 與控制組間無顯著差異。由這樣的結果推論rADI 被HBHAc已融合蛋白的方式運送進入細胞後，將細胞內的精胺酸水解成瓜胺酸。 總結，我們發現HBHAc 可以運送大分子進入細胞質及細胞核；利用化學鍵結形成conjugates 或是分生技術製備融合蛋白，皆可以有效的連接HBHAc 和蛋白質並成功地應用在蛋白質遞輸上。
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糖尿病(DM)為盛行全球的慢性病，至今超過1.5億人口患病，且有90%屬於第二型糖尿病(T2DM)。如何有效治療控制糖尿病，嚴然已成為不可忽略之重要課題。SGLT為鈉離子依賴型葡萄糖運輸蛋白，主要有SGLT1與SGLT2型態，為生理上為葡萄糖之吸收與再吸收作用。而具有選擇性SGLT2抑制劑可阻斷葡萄糖再吸收作用，被視為能有效控制血糖以開發為T2DM新穎治療藥物。 我們嘗試建立活體外之篩選系統，利用短暫表達hSGLT1之COS-7細胞株與穩定表達hSGLT2之CHO-K1細胞株為篩選系統之主要架構。透過傳統以輻射性標定受質(14C-AMG：14C-methyl-α-D-glucopyranoside)與螢光標定受質1-NBDG (2-[N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 4-yl)amino]- 1-deoxy-D-glucose)及2-NBDG (2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose)進行glucose uptake assay篩選出選擇性SGLT2抑制劑。 本系統測試Phlorizin、Dapagliflozin、Core-1及Core-2四種不同化合物。 Phlorizin對SGLT1與SGLT2皆具抑制活性，已知Dapagliflozin為已知對SGLT2有高度選擇抑制性，作為實驗正向控制組。。Core-1與Core-2為我們測試的兩個化合物。由結果得知，Core-1 (SGLT1 IC50 = 12.46 μM; SGLT2 IC50 = 0.72 nM)與Dapagliflozin(SGLT1 IC50 = 1.62 μM; SGLT2 IC50 = 0.28 nM)有相近的抑制活性。Core-2則不具任何明顯活性。 由實驗結果證明我們成功建立篩選選擇性SGLT2抑制劑之活體外系統，此系統不但可篩選其抑制劑，並可利用建立系統架構之SGLT1與SGLT2進行其詳細功能性探討。
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攝入1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) 會增加其具毒性之代謝物1-methyl-4- phenylpyridinium (MPP+) 於大腦的量，並進而選擇性的對多巴胺神經產生毒性，使得腦中多巴胺濃度降低，造成類似巴金森氏症的症狀。Amantadine在臨床上可用於治療巴金森氏症，但其機制尚未完全清楚。已知amantadine為有機陽離子轉運蛋白 (organic cation transporters，OCTs) 的受質。本研究目的於探討amantadine對於MPTP在血腦屏障穿透與MPTP引發之多巴胺毒性的影響，同時，本研究也探討腦血管內皮細胞上OCTs的表現和分布位置，以及OCTs在腦血管內皮細胞攝取MPTP扮演中的角色。 由腦部微透析實驗發現amantadine明顯的降低了大鼠與小鼠之腦透析外液中MPTP與MPP+時間對濃度做圖的曲線下面積；同樣地，相較於只給予MPTP的組別，amantadine明顯增加了小鼠腦部紋狀體中多巴胺與多巴胺代謝物濃度。小動物正子掃描之實驗結果顯示MPTP在小鼠腦中所引起的多巴胺毒性可被amantadine改善。在本研究中使用共軛焦顯微鏡和西方墨點法兩種實驗方式探討有機陽離子轉運蛋白OCT1與OCT2在腦血管內皮細胞上分布的位置，發現OCT1與OCT2主要分布在細胞膜的luminal側，並且在OCT1/OCT2基因靜默後腦血管內皮細胞攝取MPTP減少。 總結以上的實驗結果，我們發現amantadine可減少MPTP通過血腦屏障以及MPTP在囓齒類中引起的多巴胺毒性，並且OCT1與OCT2對MPTP通過血腦屏障扮演重要的角色。
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蕾莎瓦（Sorafenib）作為多種激酶的抑制劑（multikinase inhibitors），可以抑制Raf 激酶及多種酪胺酸激酶接受體，包含VEGFR、PDGFR、Flt3、Ret及c-Kit。蕾莎瓦目前在臨床上用於晚期腎細胞癌及肝癌之治療。為了改善其物化性質及發展新型具抗癌潛力的藥物，我們運用了構形限制、生物等配物及電腦模擬等三種理論方法，設計了一些蕾莎瓦的衍生物。 經由取代反應，一系列的尿素官能基生物等配物例如：氮羥基胍、氮甲氧基胍、氮苯氧基胍、氮氰基胍、二胺硝乙基、磺酰胺取代基可以接到蕾莎瓦上，而產生化合物37、38、39、54、56、58。這些化合物經由細胞毒性及酵素抑制活性測試，其中最具生物活性的為化合物56，其具有對Raf 1(IC50 27 nM)及 Flt3 (IC50 227 nM)的抑制活性。而喹啉衍生物 (17) 根據電腦模擬設計而來，在1 μM對於Flt3在48%的抑制效果，但對於Raf1卻只有26%的抑制效果。在C環上也合成了一系列的氮羥基胍衍生物，其生物活性結果顯示了第三位置的疏水性取代基對於Raf1的抑制活性是必需的，所以化合物45在1 μM對於Raf1有45%的抑制效果。
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研究背景 光動力治療（photodynamic therapy；PDT）是一種新興且低侵入性的治療方法，可應用於癌症及其它病症的治療。光動力治療可分為兩個步驟，含光敏感劑經由局部或全身性給藥並給予適當波長的光照。光敏感劑在適當波長的激發後，便會透過能量傳遞產生單態氧及活性氧分子，藉由這些毒性分子的產生，可導致細胞的死亡。但因單態氧的擴散距離短（約20 nm）且持續時間短（約10-6~10-9 s），所以光敏感劑於胞內的分布會決定光照後首要傷害的部位。金絲桃素（hypericin；Hyp）屬於第二代光敏感劑，具有光敏感與螢光的特性，適用於光動力治療及光動力診斷（photodynamic diagnosis），此外，Hyp具單態氧高產率及低暗毒性等優點，故Hyp被認為在光動力治療應用上深具潛力；但因Hyp高脂溶性，在水溶液中易產生聚集（aggregate）的現象，將不利Hyp應用於未來動物或臨床試驗的進行與發展。 研究目的 本研究中，以人類肝癌細胞Hep3B做為體外研究模式的對象。我們利用微脂粒及低密度脂蛋白（low density lipoprotein；LDL）做為Hyp的藥物載體，並且研究各類Hyp製劑在細胞攝取、胞內分布及光動力處理後所引起細胞死亡機制的差異。 研究方法 本研究中以1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（DSPC）及膽固醇做為微脂粒的主要材料，並添加不同比例的正電荷脂質stearylamine（SA），依SA所佔之莫耳比分為SA0（莫耳比0）、SA0.25（莫耳比0.25）、SA0.5（莫耳比0.5）及SA1.0（莫耳比1.0）等四類liposomal Hyp。製備之liposomal Hyp再以粒徑分析儀及螢光光譜儀分別進行粒徑及包覆率的測定。在微脂粒粒徑穩定性之分析，分別以保存穩定性及光照穩定性檢定，以供確保後續細胞實驗進行期間，微脂粒的粒徑圍完整且均一的。 在細胞實驗中，以流式細胞儀分析Hep3B細胞與各類Hyp製劑於serum-free條件下處理3小時的攝取情形，我們利用螢光影像分析、MTT細胞毒性實驗、流式細胞儀及西方墨點法，觀察各類Hyp製劑於胞內的分布及後續光照處理後引起細胞死亡機制的探討。 研究結果 SA0、SA0.25、SA0.5及SA1.0等各類微脂粒制劑之粒徑依次為183.57 ± 6.80 nm、181.53 ± 10.55 nm、174.87 ± 4.26 nm、177.90 ± 15.50 nm。Hyp包覆率分別為0.094 ± 0.003 μmole Hyp/mg DSPC、0.067 ± 0.003、0.085 ± 0.006及0.078 ± 0.010，其中以SA0及SA0.5的包覆率較高。 在Hyp細胞攝取之研究中，Hep3B細胞在serum-free培養液條件下六類Hyp製劑培養3小時，Hyp攝取量之大小比較為：Hyp＞Hyp + 2.5 μg LDL/mL（Hyp-LDL）＞SA0＞SA0.25 ≒ SA0.5 ≒ SA1.0。在Hep3B和各組Hyp製劑處理3小時後，發現各組製劑均主要以分布在內質網與高基氏體為主，但相較於正電荷liposomal Hyp（SA0.25、SA0.5、SA1.0）等三類製劑組，Hyp組、Hyp + 2.5 μg LDL/mL組及liposomal Hyp（SA0）組中，Hyp之胞內分布較均勻散布於細胞質；而三種正電荷微脂粒組中，Hyp之胞內分布則呈現顆粒狀，且有部份和溶酶體染劑（LysoSensor）產生colocalization的現象。在光動力處理後24小時，發現各組Hyp製劑之細胞毒性大小依序為：Hyp＞Hyp-LDL＞SA0＞SA0.25 ≒SA0.5 ≒ SA1.0，在2 J/cm2光照下，採用各組Hyp的 IC50進行後續的實驗，分別為：Hyp組 28.26 nM、Hyp-LDL組 45.26 nM、SA0組 83.20 nM、SA0.25組 522.89 nM、SA0.5組 551.26 nM、SA1.0組 635.16 nM。各正電荷微脂粒組在細胞攝取、胞內分布及細胞毒性的實驗上，彼此間無顯著差異，故僅以Hyp包覆濃度及包覆率較高的SA0.5製劑進行細胞凋亡機制探討。在Hyp組、Hyp-LDL、SA0及SA0.5各組光動力處理後30分鐘即可發現Hep3B細胞內鈣離子濃度均有明顯上升，各組Hyp製劑和控制組相比均有明顯差異：3.18 ± 0.78（p＜0.01）、4.33 ± 0.16（p＜0.001）、4.29 ± 0.42（p＜0.001）、3.38 ± 0.50（p＜0.01）。在光照處理後24小時，Hep3B細胞週期並無停滯現象，但四組之Sub-G1期（細胞凋亡）和控制組相比均有明顯增加（Hyp組（22.36 ± 8.67%；p＜0.05）、Hyp-LDL組（18.75± 7.64%；p＜0.05）、SA0組（16.41 ± 2.97%；p＜0.01）、SA0.5（18.76 ± 3.42%；p＜0.01））。為了進一步探究四種Hyp製劑光動力處理後之細胞死亡機制，發現各組均可見endoplasmic reticulum (ER)-stress指標蛋白C/EBP homologous protein（CHOP）及glucose-regulated protein 78（GRP-78）的活化，在細胞凋亡相關蛋白可見到caspase-3及PARP被切割且活化的現象，顯示Hyp光動力處理後將會透過ER-stress引起Hep3B細胞產生細胞凋亡。在細胞自噬指標蛋白LC3I/LC3II（microtubule associated protein light chain 3 I / II）蛋白表現上，並未發現在Hyp光動力處理後LC3II表現有增加的現象，故在本研究處理條件下，Hyp光照處理並未發現Hep3B細胞自噬的現象。 結論 在本研究中發現，各種Hyp製劑於胞內分布主要傾向分布於內質網及高基氏體，各類Hyp製劑光動力處理後將會透過ER-stress（CHOP及GRP-78的活化）引起Hep3B細胞產生細胞凋亡（caspase-3及PARP被切割且活化）。此外，正電荷微脂粒有部份和溶酶體產生colocalization的現象，光動力處理後可能會導致後續細胞死亡機制的不同，但在後續細胞死亡機制的探討上，與其他類製劑組間並無明顯差異。未來如能就Hyp製劑的組織與細胞選擇性及光動力治療效率深入探討，在微脂粒的粒徑、電荷、表面修飾及低密度脂蛋白和Hyp間比例的設計最佳組合，將期能夠在PDT的開發及應用上有所進展。
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本論文分成兩大部分：A 部分主要研究臺灣產紅花八角(Illicium arborescens Hayata)果實部位的二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物，進行分離並分析鑑定所含的prenylated C6-C3 類化合物和成分，實驗結果共分得六個化合物。其中包括了一個新的prenylated C6-C3 類化合物及一個類似prenylated C6-C3 且具有tricyclic ring system 的新骨架化合物，分別命名為illicaborin D (A1)和illicaborene (A2)。 B 部分主要研究臺灣產阿里山五味子(Schisandra arisanensis Hayata)果實部位的丙酮萃取物以及中國大陸產華中五味子(Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.)果實部位的酒精萃取物，進行分離並分析鑑定所含的木酚素成分，實驗結果共分得十一個木酚素化合物。其中包括了三個新的C18-dibenzocyclooctadiene lignans，分別命名為arisanschinins M 和N (B1 和B2)以及schisphenin A (B3)。此外，化合物B1 在結構上透過一個含氧架橋，將cyclooctadiene 上C-6 的非共軛酯基和biphenyl moiety 上C-14 連接在一起。 以上化合物的結構是利用各種物理數據，包括比旋光度、紅外線、紫外線、CD 光譜、質譜以及配合1D、2D 核磁共振圖譜，並參考相關文獻而建立。 最後，將所分得的十七個化合物進行生物活性檢測。紅花八角果實分離出的六個化合物，在八個月ICR 母鼠的初代骨母細胞其類雌激素功能評估試驗中，根據細胞活性分析方法(MTT assay)，發現化合物A2、已知化合物A4 和A5 分別在濃度為50 nM, 10 nM 和5 nM 的情況下，即具有明顯的促進細胞增生之作用，其促進率分別為146.2 %、152.6 %、163.7 %。另外，在癌細胞毒殺測試中發現化合物A4 和A5 對癌細胞株Daoy 具有些微的細胞毒殺活性，其ED50 值分別為20.87 和12.45 μg/ml。 阿里山五味子和華中五味子果實分離出的十一個化合物，在大鼠肝臟星狀細胞的抗肝纖維化作用評估試驗中，根據螢火蟲冷光 分析方法(luciferase assay)，發現化合物B3、已知化合物B7 和B10，在濃度為50 μg /ml 下，對於NF-kB 的活性壓制效果較為明顯，其抑制率分別為24.4 %、53.8 %和52.5 %。
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