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Part I：探討Evo00825對人類荷爾蒙不依賴型前列腺癌細胞之作用機轉;Part II：探討Pim-1在微小管作用劑引發的細胞凋亡中所扮演的角色

Evodiamine為由植物吳茱萸(Evodiae Fructus)分離之主成分，有研究指出其可抑制多種癌細胞的生長活性。我們實驗室獲得一系列Evodiamine衍生物，並利用SRB assay測試其抗癌活性，發現當中有很多的衍生物都比Evodiamine強10倍，其中Evo00825在眾多的衍生物中最為突出。其可抑制多種癌細胞的生長活性，包括攝護腺癌細胞(PC-3、DU145與LNCaP)、肝癌細胞(Hep3B)、乳癌細胞(MCF-7)及大量表現P-glycoprotein的乳癌細胞(NCI/ADR-RES)，其IC50約介於50至210 nM之間。由於Evo00825也抑制了NCI/ADR-RES的細胞生長，故此化合物並非為P-glycoprotein的受質。隨著時間的增加，Evo00825會造成PC-3細胞產生G2/M期停滯，並於長時間下引起細胞凋亡。根據in vitro與in vivo微小管聚合試驗與免疫螢光試驗顯示，Evo00825造成PC-3細胞不正常有絲分裂紡錘體的產生。此化合物增加cyclin B1與MPM2的表現量，使Cdk1之Thr161位置與Cdc25C之Thr48位置磷酸化，同時也造成MAP4的磷酸化，這些結果顯示Evo00825使細胞停滯於有絲分裂期。此外，與粒線體相關的訊息傳遞也受到Evo00825之影響，包括Bcl-2與Bcl-xL之磷酸化、caspase-9與-3之活化及poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)之斷裂。另外JNK抑制劑SP600125可顯著的抑制Bcl-2與Bcl-xL的磷酸化及caspase-3和PARP的斷裂，同時也阻止細胞進入有絲分裂期並降低Evo0025引起的細胞死亡。總結來說，這些結果顯示經由Evo00825引起的抗生長活性與細胞凋亡作用，是透過抑制微小管聚合、引發JNK相關的路徑，使細胞停滯在有絲分裂期及引起微小管調控之細胞凋亡途徑達到細胞死亡。 Pim-1為一種serine/threonine kinase的oncogene，負責參與細胞生長、增生與分化等多種功能，並對於攝護腺癌尤其是荷爾蒙不依賴型攝護腺癌的發生過程有密切的關係。第二篇主要探討Pim-1在微小管結合藥物於荷爾蒙不依賴型攝護腺癌細胞引發的細胞凋亡所扮演的角色，利用多種微小管結合藥物包括paclitaxel、vincristine、colchicine、evodiamine與Evo00825進行探討，結果顯示這些微小管結合藥物可透過活化轉錄因子STAT3引起Pim-1表現量的增加，利用Pim-1 siRNA可以使細胞對微小管結合藥物所產生的細胞毒性更為敏感並降低藥物所引起的G2/M期累積。根據免疫螢光試驗顯示Pim-1與微小管聚集在一起，但由微小管聚合試驗發現抑制Pim-1的表現並沒有改變微小管結合藥物所引起的微小管動態平衡。同時抑制Pim-1會減緩DNA damage sensor中ATM與DNA-PKcs的活化，但卻引起DNA雙股斷裂指標蛋白H2A.X之Ser139位置磷酸化的增加，有趣的是在comet assay中並沒有發現comet tail的增加，由此證實抑制Pim-1後細胞對於paclitaxel所增加的細胞凋亡與DNA損傷並沒有直接的關係。另一方面，根據免疫螢光試驗顯示抑制Pim-1會減少DNA-PKcs與Ku蛋白的結合，導致non-homologous end-joining (NHEJ)途徑受到抑制。總結來說，這些結果顯示Pim-1 knockdown可以抑制DNA-PKcs所參與的NHEJ途徑，使染色質保護受阻造成H2A.X的磷酸化，同樣也顯示Pim-1可以作為提高抗癌藥物活性的潛力標靶。

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高血脂病人其基因多型性與基礎生化值及史達汀效果之影響

高血脂病人血中膽固醇及三酸甘油脂 (triglyceride，TG) 過高，易造成動脈硬化、血栓及中風。目前臨床上最廣為使用的降血脂藥─史達汀 (statin) 類藥物，其能抑制HMG-CoA還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase)，進而減少內生性膽固醇合成與增加細胞膜上的低密度膽固醇受體，導致血中總膽固醇 (total cholesterol，TC)、低密度膽固醇 (low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c)及三酸甘油脂濃度減少，並使高密度膽固醇 (high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c) 濃度增加。但史達汀治療效果仍存在廣大的變異性，而基因多型性可能可解釋部分原因。 本研究共納入209位高血脂病人，使用atorvastatin (ATV) 或 rosuvastatin (RSV) 四週以上，且有治療前後血脂檢驗值供分析，再收集受試者的DNA進行基因型檢定，篩選與血脂生成、運送或代謝有關的基因，例如ABCA1、ABCG5/G8、APOA5、CETP、FDFT1、LDLR等；與史達汀代謝運送有關的基因，如ABCB1、ABCG2、CYP2C9/19、CYP3A5、SLCO1B1等，共24個SNPs，並分析基因多型性對於基礎生化值或ATV及RSV治療效果是否有相關性。另一方面，欲研究目前最強的史達汀類藥物 ─ RSV的降脂效果與安全性，擴大篩選ABCA1、APOA1、APOA5、CETP、LIPC、LPL、PPARA/D/G等48個SNPs，再進一步探討SNPs或單套型與受試者在RSV治療後TC、TG、LDL-c、HDL-c改變百分比、TG/HDL和TC/HDL比值改變量之間的相關性。 在基礎生化值方面，本研究發現7個相關的SNPs，分別為ABCG2 (rs2231142)、APOA5 (rs3135506)、CETP (rs708272、rs17245715、rs12597250)、LDLR (rs5929)、MIA3 (rs17465637)；在與史達汀降血脂效果相關的SNPs方面，本研究找到2個SNPs與ATV降脂效果有相關性，分別是LDLR (rs5925) 與LDLR (rs4508523)。在RSV方面，有4個SNPs與降血脂效果有顯著影響，分別是ABCG2 (rs2231142)、misc (rs501120)、PPARA (rs1800234)、PPARG (rs4684847)。在單套型分析中，本研究發現ABCA1之單套型，受試者若為較不常見的單套型 C-T-G-G-G-A (頻率：7.899%)，其基礎生化值中的總膽固醇與LDL-c濃度比較為常見的兩個單套型 C-T-G-G-G-G (頻率：13.177%)、T-T-G-G-G-A (頻率：12.033%) 高。在給予RSV治療後，TG濃度改變百分比在最不常見的單套型C-T-G-G-G-A中不降反而些微上升 (C-T-G-G-G-G：T-T-G-G-G-A：C-T-G-G-G-A，-23.904±24.623%：-20.192±24.596%：0.4781±37.064%，p value= 0.019)，且在TG/HDL比值改變量中下降最少 (C-T-G-G-G-G：T-T-G-G-G-A：C-T-G-G-G-A，-1.015±1.7793：-0.8910±1.3887：-0.2638±1.4789，p value= 0.016)。 本研究發現某些基因型與受試者的基礎生化值相關，顯示先天遺傳在血脂濃度方面有其重要性，且基因多型性可能影響ATV與RSV的降脂效果，故本研究可提供高血脂病人在心血管疾病危險性之預防與治療上作為參考。結果是否可於更大的台灣人族群中得到驗證，需未來更多進一步之研究。

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第一部分：開發毛細管電泳方法同時分析人體血漿中Triazole 類抗黴菌藥物濃度 第二部分：開發超高效液相層析結合串聯式質譜儀方法定量柴胡與生物樣品中柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷D之濃度

第一部分：開發毛細管電泳方法同時分析人體血漿中Triazole 類抗黴菌藥物濃度 侵入性黴菌感染發生率在過去二十年顯著增加，此種全身性感染易危及生命。Voriconazole為強效之三環類抗黴菌藥物，其為侵入性麴菌感染症（invasive Aspergillosis）治療藥物的首選。本研究首先開發且確效一靈敏且有效之掃集－微胞電動層析（sweeping-MEKC）方法以定量病患血漿中voriconazole 濃度。方析方法包括以下幾個步驟：（1）將血漿樣品利用10 M 尿素進行去蛋白之樣品前處理，（2）利用OASIS HLB cartridge進行固相萃取以淨化血漿樣品，（3）利用掃集－微胞電動層析電泳方法分析樣品，背景電解質的組成為40 mM磷酸、110 mM 十二烷基硫酸鈉和20％乙腈，voriconazole可在10.5分鐘內和血液中的內生性物質達基線分離。峰面積和遷移時間一天之內相對標準差分別低於2.8％和5.5％（n = 6），峰面積和遷移時間天與天之間的相對標準差分別低於4.1％和6.3％（n = 3），準確度介於96.5％到107.4％之間。Voriconazole校正曲線的線性範圍介於0.25 μg mL-1到15 μg mL-1之間，涵蓋voriconazole臨床有效治療濃度範圍，最低偵測濃度低於0.075 μg mL-1。 三環類抗黴菌藥物itraconazole和posaconazole同樣為常用來治療廣泛性黴菌感染的藥物，它們與voriconazole皆於個體間藥動差異大，故有療劑監測之必要性。本研究進一步開發可同時定量人體血漿中之itraconazole、voriconazole和posaconazole濃度之掃集－微胞電動層析（sweeping-MEKC）方法。分析方法中的樣品前處理條件與voriconazole前處理條件相同。最適化sweeping-MEKC條件的分析緩衝液組成為25 mM磷酸、100 mM 十二烷基硫酸鈉、13％乙腈和13%四氫呋喃，本分析方法可在13分鐘內將分析物和血液中的內生性物質達基線分離。遷移時間和峰面積同日內的相對標準差分別小於6.1％和9.6％（n = 5），峰面積和遷移時間異日間的相對標準差低於6.5％和10.9％（n = 3），itraconazole、posaconazole和voriconazole之準確度介於90.5％到111.9％之間。最低偵測濃度分別為0.033 μg mL-1、0.016 μg mL-1和0.041 μg mL-1。本方法可用於定量血漿中itraconazole、voriconazole和posaconazole的濃度以進行療劑監測與臨床研究。 第二部分：開發超高效液相層析結合串聯式質譜儀方法定量柴胡與生物樣品中柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷D之濃度 柴胡皂苷為從柴胡根部取得之活性成分，柴胡皂苷之藥理活性包含抗發炎、抗肝炎、抗肝癌、抗腎炎、抗感染和免疫調節。眾多柴胡皂苷中，柴胡皂苷A和柴胡皂苷D為主要產生藥理活性之成分，其中柴胡皂苷B2為柴胡皂苷D於胃酸中的代謝物。本研究採用超高效液相層析結合串聯式質譜儀（UHPLC-MS/MS）建立柴胡皂苷之分析方法，並用以定量柴胡及生物樣品中柴胡皂苷含量。於最適化層析條件之下，柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷D可於二十分鐘內達基線分離。研究中針對質譜儀參數做最適化調整，其中包括：毛細管高電壓、樣品錐電壓、撞擊能量、去溶劑氣體流速、離子源溫度、去溶劑氣體溫度等，定量方面使用選擇反應監測模式（selective reaction monitoring，SRM）進行柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷D之分析。本分析方法分析物遷移時間同日與異日之相對標準差小於 5.9 %，分析物峰面積同日與異日之相對標準差小於 5.6 %，柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2和柴胡皂苷 D標準品之定量極限分別為0.91 ng mL-1、1.58 ng mL-1與0.78 ng mL-1，最低偵測極限分別為0.22 ng mL-1、0.31 ng mL-1與0.33 ng mL-1。本研究已建立快速、有效與靈敏之UHPLC-MS/MS方法可同時分析三種柴胡皂苷，所開發方法的實際樣品應用性以分析植物萃取物、大鼠血清樣品與人體血漿樣品驗證。