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D型肝炎抗原調控轉錄因子TAp63之基因表現

D 型肝炎病毒（hepatitis delta virus, HDV）是一種小型球狀RNA 病毒，內部由單股RNA 基因體以及兩種delta 抗原所構成，外套膜則由B 型肝炎表面抗原（hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）及脂雙層（lipid bilayer）形成。雖然已知HDV 在HBsAg 存在下具有感染力，但是目前對於HDV 造成肝炎發生的機制目前仍未完全瞭解。 HDV 內部的兩種delta 抗原是其基因體轉譯產生的唯一蛋白質，分別為對於病毒顆粒包裹所必須的大型delta（HDAg-L）以及複製所必須的小型delta（HDAg-S）抗原。先前的研究利用報導基因表現分析（reporter gene assay）發現大型delta 抗原可以活化血清反應因子（serum response factor, SRF）調控的基因轉錄以及轉形生長因子β（transforming growth factor beta, TGF-β）訊息傳遞路徑。為了進一步瞭解delta 抗原在基因表現調控所扮演的角色，我們首先利用染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation, ChIP）證實大型及小型delta 抗原皆會坐落在宿主細胞血漿纖溶酶原活化劑抑制物-1（plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1）基因啟動子上。接著以免疫沉澱（immunoprecipitation, IP）及質譜分析，進一步探討delta 抗原與宿主細胞中參與轉錄因子之結合發現，可能與delta 抗原有結合的蛋白質中有5 個與轉錄調控有關。以免疫共沉澱證實，與細胞生長分化相關的TAp63γ確實和delta 抗原有專一性結合。另外，我們同時也發現在穩定表現大型delta 抗原的HepG2 細胞中，TAp63γ 的mRNA 及蛋白質表現量皆有增加的情形。到底delta抗原與p63 的結合和轉錄調控對宿主細胞的影響亦進行討論。

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人類核仁磷酸化蛋白質140及小型D型肝炎抗原共同調控核醣體RNA合成及病毒複製

D型肝炎病毒(hepatitis delta virus, HDV)為一具有外套膜之球狀病毒顆粒。其病毒顆粒內部是一負向、單股、環狀，全長約為1.7 kb之RNA基因體所組成。D型肝炎病毒是一種缺陷型的病毒(defective virus)，必須獲得B型肝炎病毒的外套膜才具有感染力，因此被歸類為B型肝炎病毒的衛星病毒。D型肝炎病毒可轉譯出兩種抗原，分別是小型delta抗原(small delta antigen, HDAg-S；195個胺基酸，約24 kDa)及大型delta抗原(large delta antigen, HDAg-L；214個胺基酸，約27 kDa)。小型delta抗原參與病毒基因體之複製，而大型delta抗原則與病毒顆粒之組裝有關。 先前本實驗室發現小型delta抗原與核仁素(nucleolin)的結合對於小型delta抗原分佈於核仁及D型肝炎病毒複製是重要的，並且證實小型delta抗原會與RNA polymerase I之最大次單元RPA194有交互作用。再綜合其他學者的研究，許多的證據皆指向RNA polymerase I可能參與D型肝炎病毒antigenomic RNA的合成，或小型delta抗原可能透過與RNA polymerase I之結合而調控rRNA之合成。 先前的研究發現，人類核仁磷酸化蛋白質140 (human nucleolar phosphoprotein 140, hNopp140；699 個胺基酸，約140 kDa)與RPA194相結合，此hNopp140最小結合區域已被鑑定在其胺基酸204至382之序列中。hNopp140被認為是組成核仁結構之最基礎單元，且與協助rRNA 合成有關。由序列比對發現小型delta抗原與hNopp140的第204至382個胺基酸片段有一定程度的相似性。 本研究利用GST pull-down assay證明了RPA194之region a分別會和小型delta抗原及hNopp140結合。且初步的研究結果顯示，小型delta抗原的第88至164個胺基酸與RPA194之region a有交互作用。此外我們利用蔗糖濃度梯度離心實驗觀察到，RPA194分別與hNopp140及小型delta抗原皆有共沈降之現象，而RPA194與小型delta抗原的分佈具有高度重疊性。因此我們認為小型delta抗原之存在可能會影響hNopp140與RNA polymerase I 之交互作用，進而抑制宿主細胞中rRNA的合成。此外利用間接免疫螢光染色發現，利用低劑量的actinomycin D選擇性的抑制RNA polymerase I或利用過度表現hNopp140的方式使得rRNA的合成無法進行時，此時觀察到小型delta抗原會離開核仁而轉移至核質，因此小型delta抗原在核仁中的分佈，可能與active rDNA transcription相關。更進一步利用RT real-time PCR分析發現，當小型delta抗原離開核仁時，D型肝炎病毒之複製會增加；另一方面利用干擾性核醣核酸(RNA interference; RNAi)降低RNA polymerase I 之RPA194的表現量，意外地發現D型肝炎病毒antigenomic RNA的合成有增加之現象。因此，RNA polymerase I對於D型肝炎病毒antigenomic RNA之複製是否扮演重要的角色，需要更進一步的釐清。

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人類攝護腺癌細胞中ErbB-2訊息活化間質蛋白酶原之研究

隨著攝護腺癌的病期演進，原本較為良性的癌細胞會變得更加惡性，引發癌細胞轉移以及賀爾蒙非依賴型性，進而造成癌症治療上的困難。過去的臨床研究顯示，ErbB家族中的酪氨酸激酶受體，ErbB-2，在攝護腺癌與其他各種癌症的病期演變中，扮演促進細胞癌化的角色。在攝護腺癌細胞株中，ErbB-2活化程度在代表攝護腺癌晚期、賀爾蒙非依賴型的LNCaP C-81細胞中較高，而在代表攝護腺癌早期、賀爾蒙依賴型的LNCaP C-33細胞中則較低，與臨床研究結果相符合。有趣的是，第二型穿膜絲氨酸蛋白酶–間質蛋白酶，其活化程度同樣在LNCaP C-81細胞中較高，而在LNCaP C-33細胞中則較低；此結果說明間質蛋白酶在攝護腺癌的病期演變中可能扮演著重要角色，並且也暗示著ErbB-2訊息傳遞與間質蛋白酶原活化之間的關聯性。 在本研究中，我們發現在LNCaP C-33細胞中大量表現ErbB-2時，會導致間質蛋白酶的活化增加；而降低LNCaP C-81細胞中ErbB-2的表現量與活性時，則會使間質蛋白酶的活化下降。此外，我們更進一步利用PI3K與MEK的抑制劑去研究ErbB-2下游的路徑，結果顯示，在大量表現ErbB-2的LNCaP C-33細胞中，PI3K的抑制劑LY294002能夠有效抑制間質蛋白酶的活化；反之，使用MEK的抑制劑PD98059則沒有顯著的效果。另外，在細胞生長曲線、傷痕實驗、細胞遷移與細胞侵襲實驗中，我們觀察到當間質蛋白酶的表現與活化受到抑制時，大量表現ErbB-2的LNCaP C-33細胞的侵入能力會明顯降低，但其生長力與移動力卻沒有顯著變化。綜合上述結果，我們可以得知，在人類攝護腺癌細胞中，ErbB-2的訊息能透過PI3K/Akt路徑而促進間質蛋白酶的活化，並因此而增加細胞的侵襲能力。

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GEF-H1調控RhoA訊息傳遞對細胞命運決定及移動力之探討

RhoA是多種訊息傳遞的中樞，而懸浮性的骨髓細胞常含有高量的活化態RhoA。當D2細胞受PMA刺激時，可誘使半數細胞RhoA活性降低並貼附於培養皿而分化成類單核球/巨噬細胞球樣的形態，另一部分維持懸浮狀態的細胞則仍具有高的RhoA活性但卻走向凋亡途徑。由於D2細胞在受到PMA誘發而走向分化或凋亡命運，與RhoA活性高低息息相關，故此研究旨在探討PMA誘發的分化及凋亡的細胞中，調控RhoA活性的機制。我在D2細胞中找到具有和RhoA專一性結合的GEF-H1蛋白，此具有活化RhoA的GEF-H1會和細胞骨架微管結合，當GEF-H1從微管上釋放後才具有活化RhoA的能力。在PMA誘發的貼附細胞中，GEF-H1會和微管結合而不被活化；至於PMA誘發的懸浮細胞，GEF-H1則分布在細胞質中可活化RhoA。當細胞中GEF-H1的表現受RNAi抑制時，大幅減少了PMA所引發的細胞凋亡；而過量表現不具和微管結合能力之持續活化態GEF-H1，則促進了細胞在PMA誘發下走向凋亡。因此，PMA刺激影響了細胞中GEF-H1的分布情形，進而調控RhoA活性的高低使細胞走向不同的命運。 在單層培養的附著性細胞中，藉由微管和肌動蛋白間交互作用產生極性而移動，RhoA亦調控著具收縮力的stress fibers之形成。藥物nocodazole會促使細胞中的微管瓦解而釋放GEF-H1。以siRNA抑制內生性GEF-H1表現時，會抑制nocodazole所誘發之HeLa細胞收縮及由RhoA/ROCK所調控的肌凝蛋白調節輕鏈(MLC)之磷酸化；而加入抗siRNA抑制的質體使再度表現GEF-H1，則可恢復nocodazole誘導之RhoA活化及細胞收縮能力。這些結果確立了GEF-H1/RhoA/ROCK/MLC為nocodazole誘發HeLa細胞收縮之必要訊息傳遞途徑。此外，抑制GEF-H1表現會經由影響活化RhoA情形，而降低HeLa細胞方向性移動的能力。移動中細胞前緣則因缺乏GEF-H1而產生不規則的膜波動(membrane ruffling)，並影響focal adhesion的動態變化。當GEF-H1表現受抑制時，移動中的細胞其focal adhesion kinase(FAK)的活化及下游paxillin的酪胺酸磷酸化亦隨之下降。因此，GEF-H1可藉由RhoA訊息傳遞，影響細胞前緣之focal adhesion的動態變化而影響移動力。 總括本研究證實，藉由微管的動態變化調控GEF-H1活化RhoA訊息的能力，進而影響細胞的命運決定與移動力。

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Rutin與EGCG作用於大鼠胰臟β細胞之抗糖毒性機制探討

第二型糖尿病，此後天慢性疾病對於現今人類有著重大的威脅，目前以周邊組織產生胰島素抗性與胰臟胰島β細胞功能喪失為主要探討之對象。在長時間因飲食等因素導致肥胖產生下，當體內為因應高代謝負荷量時，胰島β細胞會大量釋出胰島素促使糖類代謝，過去研究發現在肥胖個體上胰島β細胞因應體內代謝需求，產生代償性β細胞增生之現象，如此達到應對體內代謝之需求。但在長期負荷環境下可導致胰島β細胞失去對糖份感受性，最終可促使β細胞走向細胞凋亡一途，當胰島β細胞失去代償作用，同時合併周邊組織胰島素抗性之情況下，往往成為糖尿病致死之因素。過往研究中已顯示茶中富含之EGCG對於抗癌與身體能量之代謝有著顯著之功效。此外，已有研究顯示，蕎麥濃縮萃取物可有效降低於糖尿病模式動物之血糖濃度。因而針對天然物質中茶多酚物EGCG與蕎麥富含之類黃酮Rutin，對於胰島β細胞於高糖濃度的環境下，是否能提供實質上保護作用與其分子機制為何，進行相關研究與探討。 於本實驗研究顯示，EGCG與Rutin皆可以有效增加β細胞對於高糖環境培育下之胰島素釋放，並對長時間培育於高糖環境下之β細胞維持對糖份之感受性，並有效減緩β細胞長期培育於高糖環境下所導致之細胞衰亡之發生，有助於細胞生長與存活。進一步探討其分子機制，Rutin與EGCG可有效促進其PDX-1轉錄因子進入細胞核，並促進其活化。PDX-1為對於胰島發育與β細胞維持正常功能之重要因子，有效活化PDX-1可幫助β細胞生長、胰島素生成與第二型葡萄糖運輸蛋白(Glucose transporter 2)等蛋白質表現，同時發現EGCG於長時間的作用下，更可有效增加PDX-1蛋白質表現量。胰島素接受器受質IRS-2在過去研究顯示，對於β細胞生長、維持糖份感受性和胰島素生成等相關生理功能皆扮演重要角色，而β細胞長期處於高糖環境下會降低IRS-2表現而影響細胞正常功能，在同時給予細胞Rutin與合併於高糖的環境下，發現對於胰島素接受器受質(IRS-2)蛋白質表現量有顯著增加的效果，對於其活性的增加也藉由Rutin與EGCG之給予有著顯著的效果，並有效影響至下游訊號，包括Akt與FoxO1活性之表現。過去研究顯示β細胞在長期高糖環境下會促進細胞內脂肪堆積，造成對細胞的損傷與破壞，直接影響其正常功能運作。EGCG及Rutin於高糖之環境下對於β細胞皆能快速促進活化細胞內之AMPK(AMP-activated protein kinase)此激酶活性，並能有效抑制脂肪酸合成酶FAS(Fatty acid synthase)之生成，同時也抑制乙醯輔酶A羧化酶ACC(Acetyl-CoA carboxylase)活性之上升與脂質合成相關之轉錄因子SREBP1的表現，並有效減緩細胞於高糖環境下細胞內脂肪之囤積。Rutin與EGCG有效幫助胰島β細胞於調控醣類與脂質類代謝，此外，也可藉由影響細胞週期相關之蛋白質表現幫助維持細胞活性與增生，如Cyclin D1與p21，同時也作用於BAX與Bcl-2等蛋白質表現，幫助抑制高糖下導致之細胞凋亡現象。 胰島β細胞於長期高糖環境下，促使其逐漸失去正常生理功能與反應，而EGCG與Rutin兩種物質則可幫助β細胞面對於高糖所誘導產生之毒性，延續其細胞活性與存活能力，可望有效延緩糖尿病致病過程之發展。

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第一部分: 利用Dabsylation及高效液相層析系統分析茶的茶胺酸及伽瑪胺基丁酸含量; 第二部分: 龍葵葉子水萃物促使AU565乳癌細胞進行自噬作用

第一部分 Dabsyl chloride (dimethylaminoazobenzene sulfonyl chloride)，在1975年由本實驗室林仁混老師發展而成，可與氨基(amino)及胺類化合物(amine)反應(Dabsylaiton)，被廣泛的使用於胺基酸的分析，在本實驗裡，我們藉由Dabsylation反應及高效液相層析(HPLC)系統在吸光值425nm波長下，分析不同茶，包括綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶、珈碼茶 (GABA tea) 及羅布麻茶 (luobuma tea) 的茶胺酸(Theanine)、珈瑪氨基丁酸(GABA; γ-aminobutyric acid)及其他胺基酸。在我們的分析中，發現同種茶的茶胺酸不盡相同，產地及製作過程等可能影響此差異，高山茶葉似乎含有較高量的茶胺酸，不論是綠茶還是烏龍茶；普洱生茶(未堆渥發酵)的茶胺酸比普洱熟茶(經堆渥發酵)的茶胺酸多。另外，珈瑪氨基丁酸在一般茶的含量通常不高，除了珈瑪茶，我們發現一些羅布麻茶的珈瑪氨基丁酸含量很高，羅布麻茶含有高量量的珈瑪氨基丁酸是第一次被發現的。 第二部分 Solanum nigrum Linn,中文又稱為龍葵、苦葵、黑甜仔菜，為茄科茄屬植物，可在亞洲溫帶季候區之田野中發現，一般傳統中草藥描述其性味苦寒有小毒，具利水消腫、清熱解毒及保肝之功效，然而龍葵的藥用機轉乃須更進一步的探討與研究。在我們實驗室，我們使用龍葵葉子的水萃物，以MTT比較龍葵對不同細胞的效應，包括肝癌細胞、乳癌細胞、及纖維組織母細胞，發現AU565乳癌細胞較具敏感性。龍葵水葉子萃物引發AU565進行自噬作用而非細胞凋亡，其作用機轉似乎與Akt或AMPK路徑的調控無關，低濃度(< 25 μg/ml)的龍葵葉子水萃物引起之自噬作用並無法使得細胞死亡，可能是因為自噬作用被後期增加之p-Akt所抑制，高濃度(> 100 μg/ml)之龍葵葉子水萃物可抑制此增高之p-Akt進而促使細胞死亡，這些結果再一次確認了Akt對於AU565癌細胞之重要，而龍葵水萃物對於治療AＵ565相關之癌症，仍需進一步評估。