臺灣大學生物化學暨分子生物學研究所學位論文
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Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）是一種可活化PKC isozymes的酯化合物。過去的研究發現，血球前驅細胞D2受到PMA刺激時，會誘導半數細胞維持懸浮狀態，伴隨microtubules瓦解，使GEF-H1均勻散佈在細胞質中活化RhoA/ROCK的訊息傳遞，引發細胞皺縮及凋亡。另外半數細胞則進行貼附及分化，並有聚集成束的microtubules結合GEF-H1，而降低細胞中RhoA的活性。因此，D2細胞在PMA刺激下，其microtubules狀態及RhoA活性的不同，對於細胞走向分化或凋亡扮演決定性的角色。 本篇研究旨在探討PMA活化的PKC訊息傳遞，如何調控D2細胞中myosin light chain（MLC）磷酸化引發的細胞皺縮與microtubule的穩定狀態。PMA誘發的懸浮細胞具很強的MLC磷酸化，且伴隨聚集在細胞核周圍的現象。利用各種不同的PKC抑制劑，發現PKC α和β isoform均參與ROCK調控的MLC磷酸化增強及聚集。過去的研究指出，在PMA誘發的懸浮細胞與未處理的細胞中，都具有高的RhoA活性，暗示著懸浮細胞中PKC的活化，並非透過RhoA活性的上升，而更增加ROCK活性以調控MLC磷酸化造成細胞皺縮。我的研究發現arachidonic acid（AA）的刺激在in vitro可造成ROCK更強的活化，且當D2受AA刺激時同樣可以引發細胞皺縮，表示PMA活化的PKC訊息可能藉由AA在細胞中的釋放，而活化ROCK引發細胞皺縮。 Op18為具瓦解microtubules能力的蛋白，在Op18上具有四個serine磷酸化位點，且磷酸化會使Op18失去瓦解microtubules的能力。實驗結果顯示，PMA誘發貼附的細胞會呈現伸展的型態且有高量的Op18磷酸化，而PMA活化的PKC訊息傳遞，會經MEK/MAPK路徑，影響細胞伸展及Op18磷酸化。另外，抑制PKC的活性會改變Op18磷酸化的情形。我也利用二維電泳進一步分析懸浮及貼附細胞中Op18磷酸化的情形，發現懸浮細胞的高度磷酸化Op18（phospho-serine 16,25,38,63）有減少的現象；相反地，在貼附細胞則有上升的情況。由於Op18磷酸化的現象與microtubule的穩定狀態具相關性，且實驗結果顯示，在D2細胞中表現持續性非活化的 Op18-4E可促進PMA誘發細胞的貼附，表示細胞內具高度磷酸化的Op18有助於增加microtubule的穩定度，進而使細胞在PMA刺激下較容易進行貼附。因此，PKC調控Op18的磷酸化會藉由影響microtubule dynamics而促使細胞選擇不同的命運。 總結以上，PMA活化不同的PKC isoforms訊息路徑而影響細胞中MLC和Op18磷酸化的差異，藉此調控actomyosin及microtubule的動態變化而決定細胞命運的走向。
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基因治療是指利用適當的方法將基因送入細胞中，繼而穩定的表達其未能正常表現的蛋白質，而當疾病是由於蛋白質表現過量所造成的，就必須抑制其基因的表現。目前用來抑制表現的核酸物質有反意股核苷酸 (antisense deoxynucleotides)以及干擾型核醣核酸 (RNAi)，都可以使轉譯過程被停止而抑制不正常的蛋白質表現，而另外一種基因治療為基因修正，即改變基因上錯誤的鹼基而使基因表現正常。過去用來遞送核酸物質的載體主要可以分為兩種，病毒性載體以及非病毒性載體。由於病毒性載體的不穩定性，目前的遞送方式大多以非病毒性載體為主。 3β-[N-(2-guanidinoethyl)carbamoyl]cholesterol (GEC-Chol)為一以膽固醇為基礎的正價脂質，我們以莫耳數1：1的方式將GEC-Chol與膽固醇(Cholesterol)混合後，再以此GEC-Chol/Chol正價奈米微胞攜帶短鏈核苷酸並觀察其在基因治療上的應用。首先研究的是GEC-Chol/Chol正價奈米微胞攜帶短鏈核苷酸的最適條件，我們分別在不同的氮磷比 (N/P ratio)的情況下測量其大小、表面電荷、包覆率以及遞送效率等等，由實驗結果可以發現當氮磷比為3時可以有極高的遞送效率和包覆率。而在毒性測試中GEC-Chol/Chol正價奈米微胞也展現了低細胞毒性，而低細胞毒性即表示能以其遞送較大量的短鏈核苷酸以達到治療的目的。另外，以細胞存活率以及蛋白表現來觀察GEC-Chol/Chol正價奈米微胞遞送c-myc及bcl-2之反意股核苷酸的應用，也發現其為遞送反意股核苷酸的良好載體。在修正綠色螢光蛋白的實驗中，相較於市售正價微脂體Lipofectamine2000，我們發現使用GEC-Chol/Chol正價奈米微胞有2-3倍的修正機率。總結以上的實驗，GEC-Chol/Chol正價奈米微胞可以在活體外的實驗中有效的遞送短鏈核苷酸，並達到基因治療的目的。 本論文提出GEC-Chol/Chol正價奈米微胞具有高度短鏈核苷酸遞送性以及低細胞毒性，相當適合當作一基因治療的載體，此正價奈米微胞未來也可以同時加入其他藥物或是專一性遞送的導向性分子增加其治療能力。而目前正著手進行初步的活體內實驗，以GEC-Chol/Chol正價奈米微胞攜帶反意股核苷酸直接打入皮下腫瘤中，觀察腫瘤的生長情形，然而此正價奈米微胞若要在活體內應用，其最適化條件可能需要微調才能有效應用在活體治療中，這也是未來可以努力的方向。
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基質金屬蛋白酶 (MMP)屬於一種依賴鋅離子的胜肽內切酶，其在細胞外基質的重塑、表面受體的更迭、細胞膜上配體的活化扮演重要的角色。基質金屬蛋白酶-7 (MMP-7)是MMP家族中的最小成員，其C端的63個胺基酸為組成鋅離子結合模體的最小功能片段，結構為螺旋-彎-螺旋模體，所有的MMP成員皆具有此分子量為6 kDa的片段，在本研究稱作「6 kDa mini-MMP-7」。首先，在HEK293T以及CL1-1細胞中表現6 kDa mini-MMP-7，發現細胞型態呈現圓型，並且失去附著生長的能力，由TUNEL檢測細胞凋亡以及流式細胞儀分析細胞週期的結果，顯示這些細胞沒有走向細胞凋亡。接著在細胞內表現6 kDa mini-MMP-7與αv整合蛋白，經由螢光顯微鏡觀察，發現兩者共同位於細胞表面的位置。此外，由免疫細胞染色以及免疫沉澱分析法顯示6 kDa mini-MMP-7和MMP-7皆會與αvβ3整合蛋白交互作用，且發現MMP-7是透過位在細胞膜穴樣內陷的膽固醇硫酸鹽與αvβ3整合蛋白形成複合體。因此，我們構建一個含有RGD序列的MMP-7的片段「TAD」，進而由免疫沉澱分析法證實MMP-7與αvβ3整合蛋白的交互作用非關RGD序列。另外，經由共軛焦顯微鏡觀察，發現αv整合蛋白聚集的現象，而6 kDa mini-MMP-7則位於由αv整合蛋白形成的胞吞小泡之中，進而利用免疫沉澱分析法證實，6 kDa mini-MMP-7所誘導的αvβ3整合蛋白胞吞作用不是透過網格蛋白所調控。綜合以上結果，我們發現6 kDa mini-MMP-7與αvβ3整合蛋白結合在細胞膜穴樣內陷，促使αvβ3整合蛋白進行胞吞作用，由於細胞膜上αvβ3整合蛋白的降低，進而導致細胞失去附著生長的能力。由此可知，6 kDa mini-MMP-7對於αvβ3整合蛋白的更迭佔有重要的調控地位。
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LMBRD1/NESI (nuclear export signal interacting protein)是一參與D型肝炎病毒大型delta抗原核輸出之新發現蛋白質。本實驗室先前的研究證明LMBRD1會透過其α-actinin類型肌動蛋白結合位與F- actin結合，且LMBRD1 knockdown會增加細胞移動能力。 此外，LMBRD1+/-基因剔除小鼠行為上顯示有短期記憶的異常，暗示LMBRD1可能參與中樞神經系統正常功能之調控。 在本論文中，實驗結果顯示LMBRD1高量表現於小鼠大腦組織中。在利用VEGF誘導神經纖維瘤細胞株N2A分化後，發現LMBRD1之表現量在神經細胞分化過程中隨時間而提高。為了進一步了解LMBRD1對神經分化之影響，利用N2A細胞株和小鼠神經元分離培養，分別證實在LMBRD1表現量較低時，神經突之延長以及細胞遷移速度較快，但神經突分支則減少。另外，我們也利用數種神經分子標記經組織免疫螢光染色證實在LMBRD1+/-小鼠海馬迴切片中，神經纖維、神經突觸和樹突狀脊密度均下降。實驗結果亦顯示LMBRD1與多種細胞骨架蛋白質在N2A細胞免疫螢光染色中共位，包含actin與β- tubulin。另外利用免疫沉降法證實α-actinin, clathrin, AP2與 insulin receptor (IR) 在細胞中與LMBRD1共同形成免疫結合體，且其結合強度受到LMBRD1表現量影響，顯示LMBRD1可能參與內吞作用之調控。免疫螢光染色亦顯示IR與clathrin之分布會受到LMBRD1表現量影響，而AMPA受體之次單元體GluR2亦會隨著LMBRD1表現量降低而聚集在膜上，顯示LMBRD1可能影響神經突觸之傳訊。另外我們也發現在LMBRD1 knockdown細胞中，Akt的活性上升，與先前觀察到的表徵可能有關，但其活性不受insulin所活化，這顯示可能有其他訊息傳遞路徑參與其中。
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嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒 (severe acute respiratory syndrome associated coronavirus, SARS-CoV)，是2002年末至2003年之間在全世界造成廣泛感染並有 9.6% 致死率的嚴重急性呼吸道症候群 (severe acute respiratory syndrome, SARS) 的病原體，會引起患者肺部浸潤、纖維化等非典型肺炎症狀。血管收縮素轉化酵素2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)，被進一步證實為SARS-CoV感染宿主細胞的重要細胞表面受器，但是ACE2是否會參與在將病毒感染的訊息由細胞表面傳遞到細胞核中，進一步影響到宿主細胞中基因的表現，這些資訊到現在仍不清楚，而且SARS-CoV的致病機制，也還有待進一步的釐清。在本研究中，首先進行SARS-CoV的類病毒顆粒 (virus-like particles, VLPs) 系統的建構。利用會表現SARS-CoV結構蛋白質S、M、E的重組桿狀病毒 (baculovirus) 共同感染昆蟲細胞Sf9，收取細胞培養液進行蔗糖梯度離心，即可收集到純化過的SARS-CoV VLPs，並且純化SARS-CoV spike蛋白質，以模擬病毒感染的生理狀態。為了了解病毒的致病機轉，將SARS-CoV的目標細胞肺癌肺泡上皮細胞A549和SARS-CoV VLPs進行培養後，利用Affymetrix寡核苷酸微陣列系統，大規模地觀察有那些宿主細胞基因的表現受到影響。結果發現這些基因大都參與免疫反應、細胞凋零、細胞週期等反應中。其中一個受影響的基因為C-C motif ligand 2 (CCL2)。利用反轉錄即時聚合酶連鎖反應更進一步確認在A549細胞或是非洲綠猴腎臟細胞株Vero E6中，SARS-CoV VLPs及病毒的spike蛋白質均會正調控CCL2基因的表現，且由酵素免疫分析法也證實了A549細胞培養液中CCL2蛋白質的表現量增加。利用螢光素酶分析法分析CCL2基因啟動子上順式元件在SARS-CoV VLPs處理下扮演的角色，證實了AP-1的重要性，而且c-Fos與c-Jun的表現量也會增加。AP-1的轉錄活性會受到MAPKs的調控，在SARS-CoV VLPs與spike蛋白質培養下，ERK1/2的磷酸化有顯著的增加，其上游的Ras、Raf也參與在CCL2表現正調控的訊息路徑中，而不是透過IkappaBalpha-NFkappaB的路徑。當細胞預先處理專一性辨認SARS-CoV細胞受器ACE2的抗體時，會抑制SARS-CoV VLPs或spike蛋白質引起的CCL2表現量增加與ERK1/2磷酸化，而且利用抑制劑實驗證明casein kinase II會將ACE2胺基酸Ser-787位置進行磷酸化，此一磷酸化對於下游的訊息傳遞是重要的。所以本實驗結果指出，當SARS-CoV感染時，病毒spike蛋白質和其受器ACE2的交互作用，會促使ACE2磷酸化，而引起ACE2訊息路徑的活化，進而活化Ras-ERK-AP-1路徑，導致下游CCL2表現量的增加，可能是導致SARS病人肺部纖維化的原因之一。
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在全世界因癌症所造成的死亡中，肺癌占了最大的部分。肺癌可分為兩種組織型態，包括非小型細胞肺癌(約佔所有肺癌的百分之八十五至九十)以及小型細胞肺癌(約佔所有肺癌中的百分之十至十五)。非小型細胞肺癌普遍在肺癌後期才被診斷出，且伴隨著很差的預後情況。一般來說，蛋白酶失調與非小型細胞肺癌演進過程有相當強的關聯性，尤其是在細胞移動與侵襲的過程。第二型肝細胞生長因子活化抑制者 (HAI-2)是一個最近被鑑定為廣泛性絲胺酸蛋白脢抑制者，被認為可以有效地降低神經膠質瘤(glioma cancer)以及胃癌(gastric cancer)的產生與惡化。在我們先前的研究中指出，隨著非小型細胞肺癌移動侵襲能力的增強，HAI-2基因的表現就愈低，同時伴隨著細胞的型態發生改變。在高度惡化的非小型細胞肺癌中，研究指出癌細胞可透過細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的過程，改變細胞型態而提高了細胞移動能力。為了更進一步探討HAI-2在非小型細胞肺癌上皮-間質轉化演進過程所扮演的角色，我們使用了一套由台大醫學院楊泮池院長建構出可模擬非小型細胞肺癌惡化轉移的細胞模式進行研究，包括具低侵略性的CL1-0細胞以及高侵略性的CL1-5細胞。我們發現，當在CL1-5細胞中過量表現HAI-2時，上皮蛋白E-cadherin會隨之增加，另一方面，其他間質蛋白(vimentin, fibronectin, beta-catenin, N-cadherin)表現量則有減低的情形。同時，EMT的演進過程可以受到一些轉錄因子(Snail, Slug, Twist, SIP1)所調控，所以我們想更進一步了解HAI-2對於這些轉錄因子有何影響。我們結果顯示，在CL1-5細胞中過量表現HAI-2時，只有Slug的表現量有受到顯著的改變，其他轉錄因子並無發生太大的變化。此外，HAI-2可以透過降低Erk1/2, Akt, beta-catenin, MMP-9以及EGFR來調控非小型細胞肺癌MET的演進過程。進一步地，我們發現重組蛋白HAI-2可以有效抑制地非小型細胞肺癌的移動與侵襲。這些研究顯示HAI-2可以成為在癌症治療上的潛力胜肽藥物的候選者。綜合以上，我們的結果證實肺癌細胞惡化過程，藉由降低HAI-2的表現，參與肺癌細胞EMT的演進。HAI-2表現則可以透過調控EGFR, Akt, Erk1/2, beta-catenin, Slug, E-cadherin以及MMP-9協助MET的轉化過程。
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攝護腺癌是西方男性最常發生的癌症之一。在台灣，因為生活飲食習慣逐漸地西化，攝護腺癌有逐年上升的趨勢，其死亡率在癌症死亡中排名第七位。目前對於人類攝護腺癌在轉變成為較惡化或具高度轉移的分子機制，尚未十分明瞭。近年來，有相關報告提出細胞表層蛋白分解反應的失調被認為與癌症的侵襲及轉移有直接的相關性。 因此，在本篇研究中，我們想探討可受雄性荷爾蒙調控的嵌膜絲胺酸蛋白酶:第二型膜上絲胺酸蛋白酶II (TMPRSS2)，在攝護腺癌細胞演進過程中所扮演的角色。首先我們將可表現此蛋白酶膜外區域的DNA片段建構在一個帶有組胺酸標記的哺乳動物分泌載體內，利用HEK293T細胞株進行蛋白表達並純化此蛋白做為抗原，以製作抗體。與林陳鏞博士合作下，我們成功地獲得一株可專一辨認第二型膜上絲胺酸蛋白酶II的單株抗體。在三株雄性荷爾蒙非依賴型細胞株 (DU145、PC-3 及 LNCaP C-81) 及一株雄性荷爾蒙依賴型細胞株LNCaP C-33中，第二型膜上絲胺酸蛋白酶II主要表現在荷爾蒙依賴型的細胞，其表現量會隨著細胞對雄性賀爾蒙非依賴的程度及高度侵襲能力的上升而下降。當使用核糖核酸干擾技術專一地將第二型膜上絲胺酸蛋白酶II的表現抑制時，會提升細胞生長的能力，但卻會使雄性荷爾蒙接收體以及攝護腺特異性抗原 (PSA) 的表現量減低。同時，我們也發現第二型膜上絲胺酸蛋白酶II對雄性荷爾蒙所調控的間質蛋白酶 (matriptase) 活化、攝護腺特異抗原的產生以及攝護腺癌細胞的生長，都扮演著重要的角色。另一方面，在攝護腺癌細胞演進的過程中，當第二型膜上絲胺酸蛋白酶II表現受到抑制時，會促使上皮細胞生長因子接受體表現上升，進而增強細胞對上皮細胞生長因子的敏感性，易於反應生長刺激。總歸上述，本篇研究結果顯示當減少或失去第二型膜上絲胺酸蛋白酶II的表現時，會促進細胞生長以及對上皮細胞生長因子的敏感度，進而在攝護腺癌細胞演進的過程中扮演一個重要的角色。 關鍵詞: 第二型膜上絲胺酸蛋白酶II；攝護腺癌；雄性荷爾蒙接受體；上皮細胞生長因子接受體；間質蛋白酶；前列腺蛋白酶。
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具有光學性質的奈米粒子，被廣泛應用在許多研究與臨床檢測，當作細胞標定的探針，例如量子點、金奈米粒子、氧化鐵奈米粒子。量子點具有很穩定的螢光訊號，發光強且持久，在細胞標定上有很好的應用，但量子點對細胞具有高毒性，不適合用於活體偵測；金奈米粒子也具有螢光訊號，在醫療上可使用雷射激發高溫殺死癌細胞；氧化鐵奈米粒子對細胞不會產生毒性，具有磁性可作細胞分離、產生MRI訊號，在藥物遞送上，可藉由外在磁場引導氧化鐵奈米粒子到作用位置，達到治療效果。 金奈米粒子的螢光訊號是來自於表面電漿共振，而我們實驗室曾經偵測到氧化鐵奈米粒子的螢光訊號，但並未進一步去確認訊號是否存在以及發光機制，先前文獻中也未提到氧化鐵奈米粒子的螢光資訊，因此我針對氧化鐵奈米粒子作分析，確認是否具有光學特性，我們使用3β-[N-(2-guanidinoethyl)carbamoyl]cholesterol (GEC-Chol)與膽固醇混合製備成GEC-Chol/Chol奈米脂微粒(GCC)，包覆氧化鐵奈米粒子後，製成磁性奈米脂微粒，送入EMT- 6 小鼠乳腺癌細胞，使用共軛焦顯微鏡、多光子雷射激發系統偵測，在不同波長下皆可激發出螢光訊號，以及很強的倍頻訊號，且這些光學訊號在固定細胞或是活細胞中皆可偵測到，發展至活體臨床應用也相當具有潛力。而磁性奈米脂微粒所攜帶的氧化鐵奈米粒子越多，光學訊號也越強，代表這些光學訊號是來自氧化鐵奈米粒子而非脂質。 另一方面，許多文獻研究雷射激發金奈米粒子的光熱效應，使用雷射激發金奈米粒子產生高溫殺死癌細胞。氧化鐵奈米粒子同為金屬材質，之前也報導過利用磁場，可引發氧化鐵奈米粒子的磁炙效應，而我們發現雷射也可激發氧化鐵奈米粒子毒殺細胞，狀況與金奈米粒子雷同，詳細作用機制仍需進一步探討。 確定了氧化鐵奈米粒子的螢光訊號，我們要進一步確認此發光機制，以及修飾脂微粒表面，使其具有攜帶抗體的能力，專一性標靶特定受體表現的癌細胞，分辨出癌細胞跟正常細胞，也可攜帶藥物，用磁力引導到治療位置，使用雷射或是磁場激發熱治療效應，達到有效抗癌效果。
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第一部份： 蟑螂，目前已知可引起許多由人類免疫球蛋白E（IgE）所媒介的過敏性反應，包含有過敏性鼻炎、氣喘…等，但至目前為止，並非所有的致敏原都己被研究透澈，許多來自蟑螂的蛋白，都顯現出IgE結合活性，但僅有少部分有被進一歩分析與研究。為了釐清這一類的蟑螂過敏原，本研究中利用了二維電泳技術並配合N端定序、質譜儀等蛋白質學的方式進行分析。再進一步結合了生物資訊學中過敏原資料庫的運算，來輔助並找尋具潛力的新德國蟑螂過敏原。利用上述的方式，本篇研究中，共鑑定出10種來自德國蟑螂新的IgE結合蛋白而其中aldolase、 arginine kinase、enolase、Hsp70、TIM及vitellogenin蛋白都已在其它可導致過敏的物種，例如：塵蟎、蝦、植物花粉或真菌中，曾被鑑定為該物種的過敏蛋白。但都未曾在德國蟑螂上有過相類似的報告。另一方面，更進一步利用FARRp過敏源資料庫分析的結果也指出：arginine kinase、enolase及TIM這三個來自德國蟑螂的IgE結合蛋白，個別在各個不同致敏物種間的同源致敏蛋白，均存在著相當高的可能性是具有免疫交互作用。在本篇研究中，同時以人體皮膚試驗方式，驗証了vitellogenin蛋白在人體上，確實能引起典型的過敏反應。進一步分析個人化過敏蛋白IgE結合圖譜時也發現：在不同過敏病人上存在著個人化獨特的結合圖譜：不只在人體IgE與測試蛋白間結合的頻度，另外在結合強度上也存在著個人化的差異。這些發現，除了提供更多的蟑螂過敏病研究材料也同時提供了一個可能性，為將來對此類過敏疾病進行個人化醫療或臨床診斷提供更正確的資訊。 第二部份： 德國蟑螂是一種常見的室內吸入性過敏原，並被認為與過敏性氣喘疾病有關。由於其重要性，故常可見於現行過敏血清醫療檢驗項目中。近幾年來，由於分子生物學技術的進步，有許多的過敏原蛋白都已被基因選殖，並提供良好的平台以進行過敏原特性的分析，例如過敏原決定點的分析。本篇的主角，Bla g 9過敏原蛋白，是由德國蟑螂上，藉由蛋白質體學配合免疫學方式，新發現的過敏蛋白。並已完成基因解序及重組表現。利用陰離子交換管柱，我們也成功由德國蟑螂蟲體中，順利純化到均質化的德國蟑螂Bla g 9蛋白。由於Bla g 9蛋白在蛋白序列分析時，被認為是屬於精胺酸激酶酵素家族的一員，經活性鑑定，純化得到的Bla g 9，也的確具有精胺酸激酶的酵素活性。在後續以蟑螂過敏病人血清所進行的ELISA篩檢試驗中，也再次證實了Bla g 9確實具有結合病人血清中IgE抗體的活性，並且具有約五成的盛行率。 利用純化的美洲蟑螂精胺酸激酶過敏原（Per a 9）對Bla g 9所做的免疫抑制實驗證實了，精胺酸激酶是美洲及德國蟑螂中共通的過敏蛋白，並很有可能具有共通的過敏原決定點。為了找尋在Bla g 9上可能的過敏原決定點，我們利用了分子生物學的方式，成功將Bla g 9蛋白利用大腸桿菌分段表現，並檢測了各片段對於人類IgE抗體的結合活性。在後續研究中也發現，當Bla g 9 胜肽片段不包含氨基酸序列280-300時，對IgE抗體結合的能力會受到明顯的影響。但在利用合成胜肽分別合成兩段，包含280-295及290-305的序列時，卻無法保有IgE的結合活性。這結果暗示了在Bla g 9過敏蛋白上重要的過敏原決定點可能是屬於構型性的過敏原決定點。