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血栓素合成酶與突變的前列環素合成酶之結構研究

血栓素合成酶 (Thromboxane synthase) 與前列環素合成酶 (prostacyclin synthase) 均屬於細胞色素P450超家族的成員。細胞色素P450 是一群含有血紅素基團 (heme) 的酵素，並參與細胞中許多重要分子的氧化與生合成。一般而言，大部分的 P450酵素係藉由催化單氧化反應(monooxygenation) 以執行其生理功能，且反應過程需要NAPH以及氧分子的參與。然而，不同於其他P450酵素，血栓素合成酶與前列環素合成酶具有催化同分異構化反應(isomerization)的活性，由於此兩酵素作用時不需其他cofactors，因而被歸類為第三型細胞色素P450。有趣的是，前列腺素(prostaglandin H2) 為兩者共同的受質，但卻會產生血栓素以及前列環素兩種不同的產物。先前的光譜學研究已指出，兩酵素與受質在立體空間上結合的特異性是控制反應專一性的關鍵。在血栓素合成酶的催化過程中，前列腺素利用O-9與血紅素基團結合；但在前列環素合成酶之血紅素基團則與前列腺素的O-11結合。雖然血栓素合成酶與前列腺素合成酶皆以前列腺素為其生合成的前驅物，兩者卻扮演著相對的生物功能。血栓素能刺激血管收縮及血小板活化凝集；相反的，前列環素則是抑制血管收縮與血小板的活化。因此，此兩生物活性脂共同維繫心血管系統的正常運作，並與動脈粥樣硬化、休克症候群以及癌化過程密切相關。 為了探討前列腺素與酵素結合的立體特異性，我們先前已對前列環素合成酶與抑制物或受質類似物的複合體進行結構解析。結構分析可知活性中心周圍的胺基酸可能影響受質的結合模式並於催化反應扮演著很重要的角色。為了更進一步釐清這些胺基酸的重要性，我們將直接以凡得瓦力和氫鍵與受質作用的W272及N277 分別突變成alanine，希望透過結構的角度了解突變蛋白與受質的交互作用是否發生變化。另一方面，我們也將著手於血栓素合成酶的結構研究，探討與前列腺素結合的立體特異性。 我們已順利判定前列環素合成酶突變蛋白N277A及其與受質類似物複合體的晶體結構，經X-ray 繞射解析度分別為2.37 Å 及 2.57 Å的解析度，且兩者均屬於P212121的空間群。由活性中心的電子密度圖可知，突變後，雖然N277側鏈與受質O-9間的氫鍵消失了，但對受質與血紅素基團結合的方向性以及周圍胺基酸的排列並無太大變化。出乎意料的是，W272A突變會影響N277側鏈於空間中的位置，使其無法與受質形成氫鍵，由於W272的突變蛋白失去催化活性，因此可知W272及N277對催化極為重要。另一方面，為了得到可溶的血栓素合成酶，我們以MAKKTSS親水性序列取代其N端的跨膜區域。然而，目前老鼠血栓素合成酶的純化產量、純度與均質性仍然過低，尚不足以用於結晶，此為未來仍須努力的方向。

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探討受 LPS 刺激的小鼠巨噬細胞中 Oct-2 在 G-CSF 表現過程中所扮演的角色

顆粒性白血球群落性促進因子 (Granulocyte-colony simulating factor, G-CSF)為一具有促進嗜中性球及巨噬細胞分化增生能力的醣蛋白，可促使嗜中性球的前驅細胞自骨髓進入周邊血液循環，往發炎反應發生處聚集以吞噬病原體。當人體接受外來刺激例如格蘭氏陰性菌的脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS)，或促發炎細胞激素如 TNF-α (Tumor necrosis factor)、IL-1β (Interleukin-1 beta) 等因子刺激時，會使血液中的 G-CSF 濃度增加，促使身體對感染產生免疫反應。近年來G-CSF 亦被發現具有更多樣的生理功能如：保護神經、促使骨髓幹細胞進入血液循環、降低移植體對抗宿主反應(GVHD) 等，皆具生理上的應用價值。本實驗室過去的研究發現在小鼠的巨噬細胞 Raw264.7 中，G-CSF 啟動子受到 LPS 刺激時，會被 Oct-2、C/EBPβ 等轉錄因子所結合。Oct-2 在神經細胞內及 B 淋巴球中是非常重要的轉錄因子，且其表現均需要 NF-κB 的參與，但Oct-2 在巨噬細胞內的表現和功能仍尚未明瞭，故我們想知道在LPS 誘導巨噬細胞表現 G-CSF時，Oct-2 與 C/EBPβ 是透過什麼機制誘導 G-CSF 表現的。此外，本實驗室過去發表的研究指出， LPS 可誘導巨噬細胞表現 Oct-2，故其在巨噬細胞內之功能可能與免疫反應發生有關，但其詳細機制仍需進一步探討。 我們利用 G-CSF Luciferase reporter assay 探討轉錄因子 Oct-2 與 C/EBPβ間的關係，發現同時表現 Oct-2 與 C/EBPβ 時可誘導 G-CSF promoter Luciferase的活性，且其具有協同作用。我們更進一步使用 GST-Oct-2 pull-down assay 與共免疫沉澱的方式分別探討體外與體內的機制，結果皆顯示 Oct-2 可與 C/EBPβ 產生交互作用。若將位於 C/EBPβ C 端的白胺酸拉鏈 (leucine zipper) 區域去除後，此交互作用則會消失，可推測白胺酸拉鏈對於 C/EBPβ 與 Oct-2 的交互作用是很重要的。為了探討這個交互作用的功能性影響，我們在進行 G-CSF Luciferasereporter assay 時使用白胺酸拉鏈區域被去除而無法與 Oct-2 產生交互作用的C/EBPβ 與完整的C/EBPβ 競爭，發現若加入愈多無法與 Oct-2 產生交互作用的C/EBPβ，則其誘導 G-CSF promoter Luciferase 活性的效果就愈低，故可推測C/EBPβ 與 Oct-2 的交互作可提高其促進轉錄的效果。此外，若進行 GSTpull-down 時加入 Oct-1 或是 Oct-2 進行競爭，加入的 Oct-1 或是 Oct-2 愈多，可被 pull-down 的 C/EBPβ 愈少，這可能代表了 Oct-2 與 Oct-1 在結構上具有一定程度的相似性。然而在小鼠巨噬細胞中 LPS 並不會誘導 Oct-1 的表現，但可顯著誘導 Oct-2 使其表現量增加。 另外有關 LPS 在小鼠巨噬細胞中可正向調控 Oct-2 表現的部份，我們根據Oct-2 promoter Luciferase reporter assay 的結果顯示，在 Oct-2 promoter 的-205/-82 之間具有對其基礎表現量重要的序列；在小鼠巨噬細胞中以 LPS 刺激後使 Oct-2 表現量增加，則與 -349/-205 間的序列有關。然而以 NF-κB 的抑制劑Bay11-7082 進行實驗，發現在 LPS 誘導 Oct-2 promoter Luciferase 活性、Oct-2mRNA 及 Oct-2 蛋白質的過程中，Bay11-7082 皆無顯著抑制效果，故可推測 LPS刺激小鼠巨噬細胞後使 Oct-2 表現量增加，其訊息傳遞路徑並不經過 NF-κB。

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胸腺嘧啶激酶1參與DNA損傷修復之探討

在DNA複製以及修復時，提供胸苷三磷酸 (dTTP) 用於DNA合成是非常重要的過程。細胞內主要有兩條路徑可以提供dTTP 的合成，分別是新生成和回收路徑。而過去的文獻指出DNA損傷可藉由腫瘤抑制蛋白p53或非p53依賴的訊息傳導，進一步正向調控核苷酸還原酶 (RNR) 所主導的dTTP新生成路徑。此過程可以提供足夠的dTTP供DNA修復使用，而使得細胞有更好的存活率。然而，目前對於dTTP的回收路徑是否亦參與於DNA損傷反應中仍不是非常的清楚。 胸腺嘧啶激酶 (TK)是dTTP回收路徑中的速率決定酵素。由於RNR中的小亞基 (R2) 與細胞質中TK1在細胞週期中受到相似的調控，舉凡在DNA合成時期 (S phase)的轉錄活化以及離開有絲分裂時期的蛋白質降解，因而我提出兩個問題: TK1是否像小亞基 (R2) 會參與DNA 損傷反應，此外腫瘤抑制蛋白p53是否會於DNA損傷時影響dTTP 回收路徑。而在我的研究中發現經過基因毒殺藥劑處理的癌症細胞會誘導TK1表現量上升並且於細胞核中累積。而後也發現p53缺失的細胞於DNA損傷復原的過程中，TK1表現量的累積是導因於細胞透過活化G2檢查哨將其停滯於G2時期，因而缺乏有絲分裂時期的蛋白質降解機制。另外我也發現p53正常的大腸直腸癌細胞在DNA損傷時會透過細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑p21去抑制G1/S時期的進程，導致較少量的細胞停滯於G2時期和較少的TK1累積。因此在DNA發生損傷時，癌症細胞中p53的狀態可透過不同的細胞週期調控而影響TK1誘導的程度。除此之外，我亦發現在p53缺失的大腸直腸癌細胞中，TK1對於細胞的增殖是非必要的但是在DNA損傷復原時dTTP 的補給上卻是重要的。進一步探討於DNA損傷時，經正向調節的TK1主導的dTTP 其功能上的重要性，我證明在DNA損傷復原時抑制TK1表現量會降低DNA修復的效率並導致更多因基因毒性藥劑引起的死亡。總而言之，我的實驗結果暗示在基因毒性藥劑的處裡後，癌症細胞會正向調節TK1而產生較多的dTTP，有助於停滯在G2時期DNA的修復工程。 總結，我的論文研究透過整合DNA 損傷訊息、腫瘤抑制蛋白p53調節路徑、dTTP生成以及TK1的細胞週期調控歸納出負責調節dTTP合成的TK1在化學治療反應中的功能性角色。

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CRN-5與Rrp46參與核酸降解的結構及功能性研究

Rrp46 原本是真核生物外切體(exosme)的組成蛋白之ㄧ；外切體複合物(exosome complex) 是一參與核醣核酸分解的重要的核醣核酸外切酶(exoribonuclease)，可從單股的核醣核酸之3'端往5'端逐一進行分解作用，同時調控細胞內各種核醣核酸的生成與降解，此功能維繫了細胞活性的正常。因此，Rrp46 也是組成外切體複合物及維持細胞正常生長所必需。 在蛋白質分類上，Rrp46 屬於RNase PH 外切酶家族。此類核醣核酸分解酵素(RNase)，廣泛保留在從原核生物(prokaryotes)到真核生物(eukaryotes)的各類生物體中，包括細菌、古代菌(archaea)、酵母菌，乃至於植物與人類。在線蟲(C.elegans)當中，CRN-5 是Rrp46 的同源蛋白質(homologue)；被發現可能另外當作細胞凋亡(apoptosis)時，參與分解染色體去氧核醣核酸(chromosomal DNA)的新功能。本篇論文即結合了生化分析、生物物理及蛋白質晶體結構等方法，來探討Rrp46 及CRN-5 降解DNA 及RNA 時的生化特性及生理功能，為此類RNase PH外切酶的新功能提出更有利的佐証。 在此篇論文中，我們提出了CRN-5 以及稻米Rrp46 (oRrp46)的蛋白質晶體結構，它們的最高解析度分別是3.9 Å 及2.0 Å。經由分析三個不同物種(人類、稻米及線蟲)的Rrp46 重組蛋白質發現，它們以二具體(homodimer)的形式存在於體外。除了已知與外切體複合物結合外，我們也首次觀察到此二具體形式的Rrp46亦同時存在人類與稻米細胞環境中。由生化生析的結果，發現稻米二具體oRrp46重組蛋白質除了具有磷酸分解(phosphorolysis)RNA 的活性外，更首次發現能水解(hydrolysis)DNA 的生化活性；人類的hRrp46 及線蟲的CRN-5 蛋白則只具有結合DNA，而不具分解DNA 的活性。藉由蛋白質晶體結構與突變技術，我們分析稻米oRrp46 活性區域以及受質結合區裡的重要胺基酸殘基所扮演的角色。發現E160Q 的突變會明顯抑制稻米oRrp46 的DNA 水解活性，對分解RNA 的影響則有限；但是K75E/Q76E 的突變，則同時抑制了稻米oRrp46 對DNA 及RNA 的結合與分解。CRN-5 本身雖沒有DNA 分解活性，但經實驗確認，它能與另一個細胞凋亡核酸水解酶 (apoptotic nuclease) CRN-4 有直接的結合作用，並且增強CRN-4 的DNA 水解活性。推測了這兩個蛋白質可能在細胞凋亡時分解DNA 有協同作用。 綜合以上強力的研究證據，我們推測Rrp46 蛋白質會穩定形成外切體複合物以外的二具體；此二具體可能依照不同的物種，或直接扮演有活性的組成份，或扮演結構性組成份，參與細胞凋亡時分解DNA 的重要生理機制。

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幽門螺旋桿菌 GroES 蛋白在試管中及活體內誘發前發炎細胞 激素釋放

過去的研究中，幽門螺旋桿菌已被證實會造成胃部的發炎，並且與許多胃部的疾病(胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等)有高度的關連性，在本實驗室先前的研究中，發現了幽門螺旋桿菌新的致病因子 GroES 蛋白，幽門螺旋桿菌的 GroES 蛋白會使得人類周邊血液單核 細胞釋放前發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)，這個現象可能與胃癌的形成有關。然而，相較於幽門螺旋桿菌的 GroES 蛋白，大腸桿菌的 GroES 蛋白並不會造成周邊血液單核細胞產生前發炎細胞激素，在比對幽門螺旋桿菌與其他微生物的 GroES 蛋白序列後，發現幽門螺旋桿菌的 GroES 蛋白在羧基端有 28 個胺基酸片段的延伸。有鑑於此，我們想探討此一片段對於幽門螺旋桿菌的致病性是否扮演重要的角色。我們表現全長之幽門螺旋桿菌 GroES 蛋白(H. p GroES)、刪除羧基端 28 個胺基酸之 H. p ΔGroES(1-90)蛋白，以及大腸桿菌之 GroES蛋白(E. coli GroES)，並以試管內(In vitro)以及活體中(In vivo)實驗方法來探討這些蛋白的功能。在試管內的方法中，將三種 GroES 蛋白分別處理細胞後發現，不論是在人類周邊血液單核球、MKN45 細胞或是 THP-1 細胞中，都可以發現全長之 H.p GroES 蛋白會引發這些細胞高量的前發炎細胞激素介白素-8(Interkeukin 8, IL-8)表現，反觀經 H. p ΔGroES(1-90)以及 E.coli GroES 處理的組別，其介白素-8 的表現較 H.p GroES 蛋白處理的組別低。在活體中的方法中，我們使用斑馬魚當做模式生物，分別將這些種蛋白處理斑馬魚後，以定量聚合酶連鎖反應(Q-PCR)檢測這些組別其前發炎細胞激素的 mRNA 表現，結果顯示 H. p GroES 蛋白處理的組別中，其前發炎細胞激素介白素-1、介白素-8 相較其他蛋白處理組別有高量表現。接著使用原位核酸雜交法(In Situ Hybridization)染色觀察不同組別的切片後更進一步發現，H. p GroES 蛋白處理的組別，其前發炎細胞激素介白素-1、介白素-8 與腫瘤壞死因子 α(Tumor necrosis factorα, TNFα)RNA 高量表現於斑馬魚之消化系統區域，而在其他蛋白處理組別並無發現這樣的情況。綜合以上，幽門螺旋桿菌羧基端的 28 個胺基酸對於 H. p GroES 蛋白誘發前發炎細胞激素釋放扮演著重要的角色，也暗示 H. p GroES 蛋白，可能使胃上皮細胞及免疫細胞引發持續性發炎的情況。

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SB203580增加G-CSF mRNA的穩定度進而增強巨噬細胞中LPS誘發G-CSF的產生

顆粒性白血球群落刺激性因子 (Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是造血醣蛋白生長因子的成員之一，具有調控嗜中性白血球分化增生的能力。G-CSF可以經過LPS、IL-1β及TNF-α的刺激透過轉錄及後轉錄調控機制由內皮細胞、巨噬細胞及其他許多免疫細胞分泌。G-CSF mRNA三端未轉譯區 (3’ untranslated region, 3’UTR) 含有數個AUUUA序列 (adenosine uridine-rich elements, ARE) 及莖環不穩定元素 (stem loop destabilizing element, SLDE) 與mRNA的不穩定有關。有多個發炎細胞激素的3’UTR可以發現都有ARE，多篇文獻報導在p38 MAPK 訊息傳遞路徑活化下，這些含有ARE的發炎細胞激素mRNA可以由不穩定狀態變成穩定的狀態。p38α被發現與調控轉譯及後轉錄進而影響細胞激素的合成較具關聯性，p38 MAPK抑制劑SB203580可以抑制p38α與β藉由降低mRNA的半生期進而降低發炎細胞激素的產生。然而，SB203580在巨噬細胞中G-CSF的表現影響仍然是未知的。 在我們的研究當中發現，在事先經SB203580處理三十分鐘後，再以LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞及小鼠骨髓分化的巨噬細胞(BMDM)都導致G-CSF mRNA及蛋白質的表現增加，但是會抑制LPS所誘導IL-1β mRNA的表現，可以看到G-CSF與IL-1β有不一樣的反應。因此，想了解在SB203580/LPS處理的細胞G-CSF mRNA表現增加的調控機制，利用luciferase reporter assay分析G-CSF啟動子活性以及以nuclear run on assay測mRNA轉錄合成的速率，結果得知LPS可以使G-CSF啟動子活性及轉錄上升，然而加入SB203580並沒有促進G-CSF轉錄的作用。接著，我們探討SB203580是否會影響G-CSF mRNA的穩定度，對已經以LPS或SB203580/LPS處理的細胞以actinomycin D抑制轉錄後，以Northern blot看mRNA的變化，發現SB203580/LPS處理的細胞G-CSF mRNA的穩定性比起只有LPS刺激的來的穩定。為了研究細胞在SB203580/LPS處理之下G-CSF mRNA穩定度高是哪一段序列所媒介的，於是將G-CSF 5’UTR、3’UTR及coding region接至pGL3-control質體的luciferase基因前面或後面，分別為pGL3-G-CSF 5’UTR-Luc、pGL3-Luc-G-CSF 3’UTR、 pGL3-Luc-G-CSF(+35/+372) 及 pGL3-Luc-G-CSF(+340/+720)。將這些質體轉染入RAW264.7後，事先以SB203580處理或不處理，再以LPS刺激後測luciferase活性，發現轉染pGL3-G-CSF 5’UTR-Luc及pGL3-Luc-G-CSF 3’UTR兩種質體luciferase活性很低(與pGL3-control相比)，在SB203580/LPS處理之下luciferase活性並沒有比LPS處理的增強；當細胞轉染pGL3-Luc-G-CSF(+35/+372) 及 pGL3-Luc-G-CSF(+340/+720) luciferase活性與pGL3-control差不多，但在SB203580/LPS處理之下與pGL3-control相比 luciferase活性些微上升。這些結果顯示，G-CSF 5’UTR及3’UTR對mRNA具不穩定的影響，而G-CSF coding region對mRNA則有穩定的功能。最後，利用p38 siRNA致弱p38的表現，以LPS刺激後發現G-CSF的表現與negative control siRNA對照組相比較下是降低的。綜合以上結果，我們推論p38 MAPK抑制劑SB203580會提高G-CSF mRNA及蛋白質的量，可能是因為SB203580提高G-CSF mRNA穩定性的結果，但這些作用似乎不是因為SB203580抑制p38所造成的。