國立臺灣大學微生物學研究所學位論文/Graduate Institute of Microbiology
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LMP1為EB病毒潛伏期蛋白質，主要表現於細胞膜上。弁鄐W類似於持續活化之CD40。其為腫瘤壞死因子受體群成員之一，而LMP1之致癌性可由其能轉形囓齒類纖維母細胞株而印證。身為病毒潛伏期表現之蛋白質，其基因調控的相關研究皆於病毒潛伏期時進行。然而少數報導亦指出LMP1之表現量可隨病毒進入溶裂期而增加，惟對其調控機制所知甚少。 本實驗室利用基因重組之Akata株EB病毒感染293細胞，並經由挑選而得到十種分株細胞。此十種分株細胞可概分為兩型：其中一型僅表現EBNA1蛋白質而稱作潛伏期分株細胞；另一型因表現溶裂期蛋白質而稱作溶裂期分株細胞。有趣的是LMP1蛋白質於溶裂期分株細胞中有很明顯的表現量但卻無法在潛伏期分株細胞中被偵測到。利用對Zta mRNA具專一性之siRNA（si-Z1）抑制此自發性溶裂期進行後，證實病毒溶裂期之進行乃導致LMP1表現量增加之必要因素。比較帶有EB病毒之不同上皮細胞株，發現因Rta所引發病毒溶裂期進行而促進之LMP1表現量遠較Zta明顯。進一步利用si-Z1阻斷病毒溶裂期進行，發現此Rta誘導之LMP1表現量並不需Zta蛋白質的存在。藉由北方墨點法偵測可知LMP1於病毒溶裂期之轉錄產物可來自啟動子ED-L1或TR-L1之轉錄，且於不同上皮細胞有不同之偏好性。此外，利用luciferase reporter assay證實Rta可以直接促進LMP1啟動子ED-L1與TR-L1之活化，並不需要其它病毒基因產物的存在。利用TR-L1不同刪減片段突變株進行的實驗，結果顯示DNA序列170164至170108間之區域對於Rta調控啟動子TR-L1是必要的。另一方面對Rta蛋白質進行不同片段之刪減與突變，經西方墨點法與luciferase reporter assay的探查，暗示Rta蛋白質的N端、C端或核定位訊號序列對於其調控LMP1表現皆具必要性。最後我們亦於B細胞株中證實Rta引發病毒溶裂期所促進之LMP1表現量較Zta顯著，暗示Rta在B細胞中亦具有調控LMP1表現的能力。在本論文中證實了EB病毒可藉由Rta調控LMP1基因的表現，為LMP1在病毒溶裂期中所受到基因調控的機制提供了一個新的觀點，而其於病毒溶裂期中所扮演的角色及弁鄍蝑
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克雷伯氏肺炎桿菌是院內感染常見的致病菌。近二十年來，臺灣出現一種新型的侵襲性克雷伯氏肺炎桿菌原發性肝膿瘍感染，並有逐年增加的趨勢。我們以感染克雷伯氏肺炎桿菌而造成肝膿瘍的恢復期病人血清，偵測由細菌培養液收取而來的分泌蛋白質，發現一個具高抗原性的標的蛋白質。隨後以蛋白質體學的方法，先用二維電泳將此蛋白質分離，再用N端蛋白質定序、基質輔助雷射脫附游離/ 飛行時間質譜分析和液相層析質譜質譜分析等方法鑑定。最後，在液相層析質譜質譜分析的結果，得到標的蛋白質的部分胜肽序列，在和2003年年底剛完成的克雷伯氏肺炎桿菌臺大菌株NTUH-K2044完整基因體序列作比對之後，終於鑑定出此標的蛋白質的基因位於克雷伯氏肺炎桿菌大質體上第307個開放讀架（即KPP307）。KPP307的基因大小為921個鹼基對，轉譯成306個胺基酸、分子量大小為32 kDa的未知蛋白質。生物資訊學的分析結果顯示KPP307在N端有一段含25個胺基酸的訊息胜肽。我們經由蛋白質表現和西方墨點法重新確認標的蛋白質。另一方面，我們發現相較於健康人，在目前所有感染克雷伯氏肺炎桿菌而造成肝膿瘍的恢復期病人血清樣本中，利用西方墨點法皆可檢測到1：1000以上高效價的抗KPP307抗體，顯示此蛋白質在診斷侵襲性克雷伯氏菌感染上的潛在價值。然而，KPP307在侵襲性克雷伯氏肺炎桿菌致病機轉上所扮演的角色為何則有待進一步研究。
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EB病毒與其他人類皰疹病毒科成員一樣具有兩種不同型態的生活史，包括潛伏期與溶裂期。然而於體外模式中，某些化學藥劑或細胞激素(例如：TPA：12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate、SB：n-sodium butyrate或是TGF-
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陰道滴蟲ap65-1啟動子上有兩種不同的Myb蛋白質辨認序列（Myb recognition element，MRE），分別為MRE-1/MRE-2r（TAACGATA）及MRE-2f（TATCGT）序列。前人從cDNA library篩選出一系列可能與MRE序列結合的tvMybs家族，命名為tvMyb1、tvMyb2、tvMyb3及tvMyb4。本研究以西方轉漬法證明，tvMyb1的表現量以及在細胞中的分佈不受鐵離子或生長影響；tvMyb2隨蟲體生長可能發生蛋白質修飾；tvMyb3蛋白質的表現量隨著生長時間先上升而後下降；tvMyb4早期同時分佈於細胞核與細胞質中，晚期則只存在細胞質內。進而以重組tvMyb蛋白質（rMyb），進行電泳遲滯分析，以確認rMyb與ap65-1啟動子上MRE序列的結合情形。四個rMybs蛋白質對不同MRE有其序列專一性。rMyb1結合包含MRE-1/MRE-2r之A-AACGAT序列以及MRE-2f內之ATCG序列。rMyb2結合MRE-2r內之CGATA序列以及包含MRE-2f之TATCGTC序列。rMyb3及rMyb4均結合在MRE-1。進而利用一系列刪短蛋白質，進行tvMyb的DNA結合弁鈰洃尷R；發現rMyb1之R2R3區域對MRE-1/MRE-2r及MRE-2f序列有相同的結合能力，其C端正向調控R2R3區域結合MRE-1/MRE-2r序列之能力，而負向調控R2R3區域結合MRE-2f序列之能力。rMyb1 N端負向調控R2R3區域結合兩種MRE序列之能力。rMyb3鄰近R2R3（53-150）之C端區域151-160，則正向調控rMyb3之DNA結合能力。由於各tvMybs的表現狀況與存在於細胞核內的時機各有不同，而且對MRE序列的結合強度不同，各tvMybs蛋白質和ap65-1啟動子結合時，可能有一種互相競爭的關係，藉此調控啟動子的活性。
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細胞內的蛋白質激酶在訊息傳導、細胞週期的調控等弁鄐W扮演著重要的角色，而病毒蛋白質激酶除了可以調節病毒的複製週期外,也可能透過磷酸化宿主蛋白質，影響細胞蛋白質的弁遄CEB病毒的BGLF4是EB病毒唯一已知的Ser/Thr蛋白質激酶(protein kinase)，屬於溶解期早期表現的基因產物，BGLF4有自我磷酸化的現象，並有磷酸化EA-D、EF-1δ和ganciclovir的能力。在本篇研究中，以酵母菌雙雜交(yeast two hybrid)的方式篩選帶有EB病毒的類淋巴球母細胞株互補基因庫，發現BGLF4可分別與基因體核苷酸切除修復中負責辨認錯誤DNA的蛋白質XPC (xeroderma pigmentosum complementation group C)，和腫瘤抑制因子BRCA1的共同抑制因子ZBRK1 (Zinc finger and BRCA1-interacting protein with a KRAB domain 1) 產生交互作用。因為這兩個蛋白質都參與細胞內DNA修復機制，故進一步探討BGLF4與XPC之間可能的交互作用，同時也研究BGLF4對細胞DNA修復能力可能的影響。首先利用共同免疫沉澱法證實無激酶活性的BGLF4突變蛋白質和HA tagged XPC蛋白質片段的交互作用。以免疫螢光染色觀察BGLF4與XPC在HeLa細胞內表現的位置，發現兩蛋白質在細胞內位置有部分重疊。在宿主細胞質體再活化試驗中，發現BGLF4可以促進p53缺失的H1299/bcl2細胞修復受損DNA的能力，而在XPC突變的XP4PA-SV細胞中則無此現象。至於BGLF4促進細胞修復DNA的能力是否經由需要XPC的機制，或是藉由其他的途徑，仍需進一步的研究。
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Rta是由EB病毒裂解期特早期基因BRLF1所表現的產物。其可以藉由直接結合到DNA上、或者經由細胞因子作用的方式，轉活化許多EB病毒裂解期基因及細胞基因的表現，進而促使EB病毒由潛伏期轉變成裂解期。Rta的胺基酸序列上具有三個重要的功能區段，包括N端的雙體形成區段、DNA結合區段、以及C端的轉活化區段。本實驗將各種Rta刪減片段質體--包括R1-119 (Rta N端第1-119個胺基酸)、R1-333、R1-441、R100-333、R100-605、R364-441、R401-441及R401-605，單獨轉染入NA細胞，發現任何形式的刪減片段均無法促進EB病毒裂解期發生；且去除C端164個胺基酸的刪減片段(R1-441)，會抑制全長Rta所誘導的裂解期蛋白質如Zta、EA-D、DNase、主要DNA結合蛋白(major DNA binding protein, mDBP)、BHRF1、以及BGLF4的表現，且抑制Rta轉活化BGLF5、BRLF1、及BZLF1啟動子的能力；因此可將R1-441作為一個具有顯性抑制效果的Rta突變。經由雙向免疫沈澱法以及更細部的刪減片段分析，顯示R1-441會與Rta形成異雙體，而有抑制Rta的功能；而當N端99個胺基酸刪減後，所得之R100-441則無法和Rta形成異雙體，也不具有抑制效能。但實驗結果也發現，另一個刪減片段R1-333，同樣也能與Rta形成異雙體，且缺少C端轉活化區段，卻不具有顯性抑制效能。
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本研究探討儲存於2％福馬林液內，於4 oC下保存14個月之犬蛔蟲受孕卵，對鼷鼠的感染性、致病性、幼蟲的移行行為和TGF-β1、TG2、collagen和apoptosis於所引致的肉芽腫肝炎的表現情形。感染鼷鼠後第1、2、3、5天至第1、4、8、12、16、20、24、28、42與67週，麻醉後以心臟穿刺採血致死收取血清，另將每隻鼠一半的肝臟和肺臟(肝肺期)與肌肉和腦部(神經肌肉期)組織製成蠟塊，進行組織學與免疫化學染色；另一半的內臟組織以酸性的胃蛋白酶消化進行幼蟲回收實驗。選擇台灣山地原住民成人為血清流行病學的研究對象以瞭解台灣地區人羣感染犬蛔蟲症的情況。感染鼠整體的免疫反應類型主要朝向Th2，因血清中IgG1抗體力價於整個實驗中明顯較未感染控制鼠的高 (P < 0.05)；然而Th1免疫反應的指標，IgG3抗體力價於整個實驗中，除在第八週於感染組鼠中較未感染控制組鼠的高 (P < 0.05)外，其餘感染組鼠與未感染的控制組鼠間並無明顯差異 (P > 0.05)。於整個實驗中，肝臟與肺臟的病變為中度(2+)至重度(3+)，肌肉的病變為輕度(1+)至中度(2+)，而腦部則為正常(0+)至輕度(1+)。感染第8週後大部分的鼠膽管上皮細胞可見似apocrine的特殊病變。另外靠近肌肉區的柔軟組織可於數個感染組鼠發現包住幼蟲的肉芽腫。大部分的幼蟲於感染後7天內移行至肝肺期，此後，大部分的幼蟲轉為移行至神經肌肉期。綜合而言，不僅保存14個月的犬蛔蟲受孕卵的感染性、致病性與孵化的幼蟲於小鼠體內的移行行為皆保留不變，孵化的幼蟲亦能於小鼠體內引起一些特殊的病變。TGF-β1主要被偵測於病灶處的浸潤細胞與膽管上皮細胞，分別於感染後第12週與第24週有最高的表現量。幼蟲本身亦有相當強的TGF-β1的表現。TG2主要被偵測於膽管上皮細胞與於病灶內或圍繞病灶周圍的肝細胞，分別於感染後第1週與第28週有最高的表現量。肝細胞、膽管上皮細胞與浸潤細胞罕見凋亡的發生。TGF-β1可能與TG2合同刺激膠原蛋白的生成，因TGF-β1和TG2的表現分別與膠原蛋白的表現間有統計學上的相關性。表現TG2而圍繞於病灶週邊的肝細胞形成一屏障似地，似乎可限制幼蟲移行甚或阻止病灶擴增，然而持續且不正常的膠原蛋白的堆積和罕見浸潤細胞凋亡的表現，可能造成肝臟不可逆性的纖維化損傷和持續性的發炎。本結果或可提供發展有效的控制藥物或疫苗的策略，藉調控TGF-β1與TG2的表現，達到治療由其他微生物所造成的類似肝病。5個原住民族群的成人整體血清抗體陽性率(46.0%, 247/537)明顯高於漢族(30.2%, 13/43) (P = 0.04)。年齡而非性別，似乎是與血清陽性有關的一個因子。有攝食生豬肝經歷(Odds Ratio (OR) = 1.65, P < 0.01)，眷養狗經驗(OR = 1.76, P < 0.01)，或職業是勞工(OR = 1.78, P = 0.01)的原住民成人，似乎較那些沒有上述經歷者與無工作者易於受犬蛔蟲的感染。
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胃相關黏膜組織淋巴瘤的發生與Helicobacter pylori的感染相當有關，所以在抗生素的治療下約有50%至70%的病患會痊癒；但仍有相當比例的病患無法以抗生素治療來治癒。而Bcl10蛋白質在核內的不正常表現被認為是這些無法以抗生素治療的病患相當重要的指標之一。以免疫組織染色觀察Bcl10蛋白質主要表現在正常B細胞的細胞質中，而其弁鄍D要是參與T細胞與B細胞受體調控NF-kB活化的路徑。所以在這篇論文裡我們所想要探討的問題是Bcl10是藉由何種機制的調控而進入細胞核。 第一部分，我們分析了包括T細胞淋巴瘤、Burkitt’s淋巴瘤、肝癌、鼻咽癌、子宮頸癌上皮、肺癌、以及乳癌等細胞株內Bcl10的表現及分佈。以北方及西方墨點分析皆發現在這些細胞株內的確有Bcl10蛋白質的表現。在這些細胞株內，Bcl10蛋白質分佈在細胞核與細胞質內，且這樣的細胞內分佈似乎與NF-kB活性的高低無關。 接下來，我們在Bcl10基因後面接上綠螢光蛋白基因(GFP)以便直接在顯微鏡下觀察Bcl10在細胞內的分佈；同時我們也製備Bcl10L41R來研究CARD domain對於調控Bcl10蛋白質在細胞內分佈的影響。Bcl10蛋白質和Bcl10GFP融合蛋白質在細胞內可以活化NF-kB，而Bcl10L41R蛋白質則失去活化NF-kB的能力，這樣的結果與其他的研究報告相符。大量表現Bcl10蛋白質和Bcl10GFP融合蛋白質，會在細胞質內形成絲狀構造；但CARD domain突變的Bcl10L41R和Bcl10L41RGFP融合蛋白質則均勻分佈在細胞核、質內。所以CARD domain對Bcl10活化NF-kB和形成絲狀構造相當重要。另外一方面，我們也在SDS-PAGE的實驗中發現Bcl10蛋白質的位置較Bcl10L41R蛋白質高；而以鹼性去磷酸酵素處理後Bcl10位置高於Bcl10L41R的這種現象就消失，因此Bcl10蛋白質在細胞內會被磷酸化。除此之外，我們也利用放射性磷酸鹽標定實驗證實Bcl10蛋白質的確會在細胞內會被磷酸化，而且CARD domain在Bcl10蛋白質的磷酸化過程中也扮演了相當重要的角色。 Bcl10GFP融合蛋白質在細胞內形成的絲狀構造並不會受到外界的刺激（如TPA、Sodium butyrate、UV、ionizing irradiation、TNF-ㄐ^而改變；但是HBx蛋白質卻可以藉由降低Bcl10GFP融合蛋白質的表現，使Bcl10GFP融合蛋白質在細胞內呈現均勻的分佈。但HBx蛋白質降低Bcl10GFP融合蛋白質表現的機制需進一步的研究探討。此外，我們也成左瑪鼢犍X可誘導穩定表現Bcl10GFP融合蛋白質的Hep G2細胞株。與之前在短暫細胞轉染的實驗中不同，Bcl10GFP融合蛋白質在細胞內並不會形成絲狀構造，而是呈現均勻的細胞內分佈。Bcl10GFP融合蛋白質在誘導細胞株與短暫細胞轉染間顯著不同的表現，我們將會在內文進行探討。
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RNA interference (RNAi) 為一普遍存在於動物及植物細胞中的機制，由雙股RNA與其序列上有互補的目標mRNA結合之後，造成目標mRNA的分解。在哺乳動物細胞，可經由外送約21個核苷酸的小片段雙股RNA (siRNA)至細胞中而引發RNAi的產生。在本實驗中，我們試圖評估以siRNA作為治療B型肝炎病毒(HBV)感染的可行性。 在本實驗的第一部份，我們想瞭解是否能利用siRNA在肝癌細胞株中作為控制基因表現的工具。首先針對綠色螢光蛋白質(GFP)的基因序列設計了兩個siRNA，利用pSUPER載體表達siRNA，發現能夠在不同的肝癌細胞株(Hep G2, Huh 7, PLC/PRF5 and Hep 3B)中有效並具特異性地降低GFP的表現。接下來針對HBV基因體我們建構了六個表達siRNA的質體(命名為pSUPER/HBx1, pSUPER/HBx2, pSUPER/HBx3, pSUPER/TP, pSUPER/RT, pSUPER/ε)，將這些表達質體各別與pHBV48共同轉染至HepG2細胞中，以北方墨點法分析這些siRNA表達質體抑制pHBV48轉錄本表現的效果。六個pSUPER質體均能表現siRNA。然而，針對HBV基因體上相當具保守性、且與encapsidation有關的序列所設計的pSUPER/ε無法抑制HBV轉錄本的表現。pSUPER/TP，pSUPER/RT及pSUPER/HBx3則證明了在共同轉染的系統中能夠有效並特異地將HBV轉錄本分解。 HepG 2 2.2.15為一能夠持續穩定表現HBV轉錄本及產生HBV病毒顆粒的細胞株，實驗的最後一部份，我們以HepG 2 2.2.15細胞為模式模擬慢性肝炎的患者，觀察siRNA是否能對於已存在於細胞中的HBV複製造成影響。我們採用兩種方法企圖提高細胞的轉染效率，其一是將pSUPER/TP(Hyg)，pSUPER/RT(Hyg)及pSUPER/HBx3(Hyg)各別轉染至HepG 2 2.2.15細胞後，經過Hygromycin篩選後所建立的pooled clones，雖然這些pooled clones能夠表現siRNA，但對於HBV轉錄本並沒有明顯的抑制效果。此外我們建構以lentiviral vector為骨架表達siRNA的質體，利用病毒感染的方式將質體送入HepG 2 2.2.15細胞中，發現可以將轉染效率提高至80~ 90 %以上，然而對於HBV轉錄本只有約30~ 40 %的抑制效果。綜合上述結果，對於siRNA是否為治療慢性肝炎一個良好的工具還存有不確定性，相關的問題及解決方法將會在內文中詳加討論。
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由四型登革病毒（DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4）引起的流行目前仍是熱帶及亞熱帶地區極重要的公共衛生之問題。台灣地區登革熱流行主要在南部，自從1987-1988年高雄地區第一型登革病毒大流行之後，每隔三至五年即有一次較大的流行，2001-2002年高雄及屏東地區的第二型登革病毒大流行更是十多年來最大的一次流行。 根據流行病學上的觀察，高雄地區在2001到2002年間，雖有零星的第三型病毒之病例，但是並沒有造成第三型病毒的大流行，這與第二型登革病毒之大流行形成極大的對比。因此我們第一個假設為高雄地區過去有數次第一型登革病毒流行的紀錄（例如1987-1988, 1991），當地居民體內的對抗第一型登革病毒之抗體對第三型的病毒可能有相當的的保護效果，所以蚊子體內的第三型病毒無法在人體中大量繁殖，造成大流行。另一假設為2002年的流行可能與抗體促進效應有關，高雄地區的居民體內的對抗第一型登革病毒之抗體，會藉由Fc 受體促進第二型病毒的感染，使其在人體中大量繁殖，導致2002如此嚴重的流行 本研究的第一個目標是探討高雄地區2001-2年在人體或蚊子內之第二型及第三型登革之病毒基因序列及基因型。第二個目標是探討高雄地區單一的第一型登革病毒血清（monotypical DEN-1）對該區2001-2年第二型登革病毒的影響，是否有抗體促進效應，以及對第三型登革病毒之影響，是否有部分中和的效果。 我們首先分析2001-2002年疫情期間於高雄地區所捕捉的蚊子，發現在蚊子體內分別帶有第二型及第三型的登革病毒，進行序列分析後發現蚊子體內的第三型病毒，與台南1998所流行的第三型病毒為同一基因型（genotype），在部分E (envelope) 基因的序列非常相似；這顯示到2001-2年期間台南1998年所流行第三型登革病毒仍存在於蚊子體內，但可能在人類中傳播的效果不好，所以沒有引起流行。第二型病毒的序列分析顯示不論在人體或蚊子中都十分類似，2001-2病毒株在E基因沒有太大的改變，僅有一個胺基酸變化，位於第46個位置。 第二部分的研究我們由2002年6月大流行之前，在高雄三個地區（三民區、小港區、前金區）所收集的血清中，利用PRNT（plaque reduction neutralization test）找到25個monotypic DEN-1的血清，進一步探討這些血清對1998年的DEN-3及2001-2002年的DEN-2病毒之影響。 針對第三型病毒的部分，由PRNT的結果顯示，這些血清對於1998年的DEN-3病毒株與H-87相比，的確有較高的中和效價(p <0.05)，這支持我們的第一個假說。對於DEN-2的抗體促進效應的部分，以分離健康者的周邊血液單核球細胞為感染的細胞，病毒的複製曲線在感染後第五天達到高峰，分析23個monotypic DEN-1血清對2001年DEN-2病毒株的影響發現，大多在稀釋100倍有較高的增強作用可讓病毒量增加1.7倍到6.8倍，以增加1.5為臨界值，18個（78％）血清具有抗體促進效應，增強2001年DEN-2病毒之複製，這支持我們的第二個假設。 本研究之整體目標是探討2001-2002年高雄屏東地區DEN-2大流行是否有一些生物學上的理由，特別是當地居民過去曾感染登革病毒之血清學情況（status）對這次流行之DEN-2病毒株之影響，以及該區DEN-3病毒株之影響，實驗結果支持我們的假說，顯示病毒-宿主交互作用對流行的重要性。雖然仍有釵h環境及人為等諸多因素影響是否造成大流行，我們的研究提供了一個可能的生物學上的解釋。未來衛生單位應可藉由類似的實驗方式，分析蚊子中病毒株的流行潛力，及早做出防範措施，減少疫情的嚴重度。
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