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台灣產水生菌感染斑蚊幼蟲之研究

使用採自台北、宜蘭、花蓮、新竹、苗栗、台中、台南、南投、嘉義、雲林、高雄、屏東的土樣樣品453個以及水樣18個，以一齡斑蚊幼蟲做釣餌，從中分離出五株對斑蚊幼蟲有病原性的水生菌，此五株均分離自花蓮縣兆豐農場的土樣，經鑑定後，其中有四株是腐黴菌(Pythium spp.)以及一株Saprolegnia megasperma。土壤分離率為1%，由人工耕地分得的分離率為4%，天然林地及水邊土樣之分離率為0%。將五株水生菌作植物病源性測試，發現Saprolegnia megasperma接種於青梗白菜種子則會造成青梗白菜種子不發芽以及造成褐根，接種四株腐黴菌青梗白菜及莧菜種子的發芽率為80~100%。 四株腐霉菌菌絲最適生長溫度分佈在24-32℃，而Saprolegnia megasperma的最適生長溫度為16℃-32℃，在光線為全暗的狀況下，五株水生菌在4℃以下及40℃以上停止生長，四株腐霉菌也以全暗的情況下生長較佳。Saprolegnia megasperma在不同光照下，則以全光時生長勢最佳。在不同水質中，以魚缸水作處理腐黴菌菌絲塊，四株腐黴菌都可獲得最大游走子產量。除90028外，另外三株腐黴菌培養七天之菌落可獲得最大游走子數。游走子產量隨天數增加而增加，腐黴菌90028則剛好相反，培養七天的菌落游走子產量最少，培養三天的游走子產量最多。90027對一齡埃及斑蚊以及白線斑蚊的半致死濃度分別為7.8 zoospores/μl以及11.9 zoospores /μl，90028對一齡埃及斑蚊以及白線斑蚊的半致死濃度分別為18.1 zoospores /μl以及16.6 zoospores /μl，90034對一齡埃及斑蚊以及白線斑蚊的半致死濃度分別為36. 5 zoospores /μl以及30.7 zoospores /μl，90037對一齡埃及斑蚊以及白線斑蚊的半致死濃度分別為27.1 zoospores /μl以及35.6 zoospores /μl。 觀察接種24小時的一齡斑蚊幼蟲，死亡的斑蚊幼蟲在肛節腮有大量團狀菌絲，夾雜著部分靜止子。接種48小時後觀察，大多數被感染斑蚊幼蟲體軀長出孢囊，嚴重者整隻被白色菌絲包圍住，只露出部分身體。在掃描式電子顯微鏡下觀察接種2小時的斑蚊幼蟲，僅少數一、兩隻可在體表觀察到少量靜止子附著，接種四小時，已可在斑蚊幼蟲肛節腮處觀察到有靜止子大量聚集附著的現象，觀察接種六小時的斑蚊幼蟲，除觀察到有靜止子大量聚集，還可發現多數靜止子都已經發芽。

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表現幾丁質分解酵素活性的螢光假單胞菌Pseudomonas putida對植物病害防治之影響

土壤中存有大量根圈細菌，這些細菌能夠群聚並長期存活於植物根圈，分泌物質提供植物養份，並促進植物生長，被稱為促進植物生長之根圈細菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)。許多PGPR菌株為螢光假單胞菌(fluorescent pseudomonads)，已知多種Pseudomonas fluorescens及Pseudomonas putida菌株能防治植物之葉部及根部病害。以生化方法收集P. putida拮抗菌株LY95及其產生幾丁質分解酵素之遺傳工程菌株的周質、細胞質、內膜和外膜分段液，比較幾丁質分解酵素的活性，在P. putida LY95(pMMST2000)外膜及內膜可偵測到幾丁質分解酵素，利用西方免疫法估計其分子量約為94 kDa。 P. putida LY95(pMMST2000)經免疫螢光染色，以螢光顯微鏡及雷射共軛焦掃描顯微鏡觀察，均可在其一細胞表面觀察到螢光。螢光基質分析顯示P. putida LY95(pMMST2000)之培養上清液也可偵測到幾丁質分解酵素活性；以P. putida LY95(pMMST2000)培養18小時之上清液處理百合及番茄之萎凋病菌及灰黴病菌，皆有抑制孢子發芽的作用。於溫室中，P. putida LY95(pMMST2000)能有效地降低百合及番茄萎凋病及灰黴病的罹病度，顯示表現幾丁質分解酵素分佈於細胞表面的方式，可增加P. putida之抑菌活性及生物防治活性。

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台灣百合根圈細菌之篩選及灰黴病防治應用研究

植物在受到生物或非生物因子的刺激，會使植物之生理生化發生改變，造成植物開啟多重複雜的防禦機制，使植物具有對抗非生物逆境及病原菌侵染的能力，以適應環境的變遷。目前在植物體內的防禦機制可分為先天及誘導抗病性；誘導抗病性之區分為systemic acquired resistance (SAR)、induced systemic resistance (ISR)及過敏性反應(hypersensitive response, HR)等。百合灰黴病菌(Botrytis elliptica [Berk.] Cooke)危害百合葉片及花器，為百合重要病害。為開發適用於台灣百合(Lilium formosanum Wall., Formosa lily)的生物防治菌株，自台灣百合根圈採集土壤樣品，以土壤稀釋平板法分離及純化出62株細菌菌株，並經氣相層析儀分析脂肪酸的組成及含量以鑑定菌種。將不同菌株細菌懸浮液澆灌在台灣百合根圈，篩選對百合植株沒有負面影響，甚至略有促進生長作用之菌株，在台灣百合及葵百合(Lilium ‘Star Gazer’)上進行溫室防治試驗，並在台灣百合、葵百合及阿卡波克百合(Lilium ‘Acapulco’)上進行實地田間防治試驗，結果顯示皆能有效地降低灰黴病罹病嚴重度及減少病斑的數目，顯示可以應用根圈細菌保護百合之地上部組織，避免灰黴病的危害；進一步為獲得百合抗病性表現的相關基因或分子標記，以PCR-select cDNA subtraction方法獲得百合受根圈細菌誘導表現之mRNA互補股DNAs，其中有23個cDNA選殖株在根圈細菌處理後有差異性表現。

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影響利用蠟蚧輪枝菌防治害蟲之因子

供試之各種蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)菌株生長時對溫度的反應頗為一致，在16~28℃間菌絲生長良好，且於12℃之低溫處理下仍可生長，但32℃時僅少數菌株稍有生長反應，除F168菌株在20℃生長最佳外，其餘菌株均以24℃為其生長最適溫。菌株在產孢上的表現差異大，在各相關最適產孢溫度下，產孢量有百倍以上之差，各菌株最適產孢溫度也明顯有別，以F096產孢最佳，F168最差。除F168菌株外，各菌株之孢子發芽速率相近，14小時之培養觀察，分生孢子發芽率均達76%。菌株在鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、酯酶/脂酶(C8) 〔esterase/lipase (C8)〕、亮胺酸芳基醯胺酶(leucine arylamidase)、酸性磷酸酶(acid phosphatase)、

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利用逆墨點雜合法鑑定九種馬鈴薯Y屬病毒

Potyviridae科中的Potyvirus屬，是植物病毒中最大的一屬；目前所知的種類近200種，對人類的糧食及經濟作物造成的危害頗大。因為馬鈴薯Y屬病毒的種類繁多，因此發展出一套能快速檢測並區別各種病毒的鑑定方法，將有助於植物檢疫與防疫工作。生物晶片是21世紀的生物技術重點產業，最大特點就是在同一片晶片上，可同時處理多項訊息。本論文希望利用晶片和potyvirus的特性，建構potyvirus的鑑定晶片系統。晶片上的探針分為cDNA探針和寡核苷酸探針兩種，其序列位置均落在potyvirus的NIb基因3’端和CP基因5’端之間。標的物是以potyvirus的cDNA株或感染potyvirus的植物全RNA，與potyvirus的廣效性引子對進行PCR或RT-PCR反應時，加以標定得之。將cDNA探針固定在尼龍膜上後，與標的物進行逆墨點雜合反應，結果發現所製備的cDNA探針專一性很好。由此所建構的cDNA晶片可以正確地鑑定出BaRMV、PRSV、PVA、PVY、TuMV、 ZaMV和ZYMV等八種病毒單獨感染的植物樣品。此外，cDNA晶片也可以正確的鑑定出兩種或三種複合感染的植株。而為了確定寡核苷酸探針的最適長度和最佳雜合條件，我們根據ZaMV和ZYMV的序列，設計不同長度的寡核苷酸探針，結果以50 mer的效果最好。故針對不同的病毒，設計50 mer寡核苷酸探針，固定在尼龍膜上，與標的物進行逆墨點雜合反應，結果發現這些探針的專一性相當良好。由此所建構的寡核苷酸晶片可以成它a鑑定出上述八種病毒；同時也可以成它a鑑定複合感染的樣品。檢視兩種晶片的鑑定結果，雖然cDNA探針靈敏度較寡核苷酸探針為高，但是寡核苷酸探針擁有不須具備病毒cDNA株即可製備的優點。日後若有新種病毒出現或是原有病毒序列產生較大變異，則只需加入新的寡核苷酸探針即可維持鑑定晶片系統的完整性，應該是未來發展的趨勢。