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冷震處理影響Streptococcus thermophilus在後續一些致死壓力下之存活

Streptococcus thermophilus為具耐熱性乳酸菌，常用於酸凝乳及一些起司之發酵上當作菌酛。本研究乃在探討S. thermophilus BCRC 14085於不同冷震條件 (10℃、15℃或20℃下經2或4 h) 處理後，在後續致死壓力環境下如在高溫 (58℃)、酸性 (pH 2.5)、高滲透壓 (75% sorbitol)、乙醇 (20、25%)、有機酸 (0.75 M丙酸、乳酸、醋酸、檸檬酸及酒石酸，pH 3.5)及模擬胃腸液下 (pH 2.0-3.0) 之存活情形。 結果顯示，S. thermophilus所呈現之冷震效應會因冷震條件及測試壓力種類之不同而有所差異。以10℃-2 h、10℃-4 h及15℃-2 h冷震處理可顯著 (p＜0.05) 提高S. thermophilus於-20℃環境下之存活率，但20℃- 4 h冷震處理卻反而提高菌體於-20℃環境下之敏感性。S. thermophilus接受10℃-2 h及10℃-4 h冷震處理後顯著(p＜0.05) 提高其於58℃、酸性 (pH 2.5) 及高滲透壓環境下菌體之耐受性，但以20℃- 2 h 及20℃- 4 h冷震處理者在58℃、酸性 (pH 2.5) 下之忍受性則降低。此外，10℃-2 h冷震處理菌體在25%乙醇環境耐受性比控制組高。惟在0.75 M乳酸或醋酸溶液 (pH 3.5) 中，其情形剛好相反。10℃-2 h冷震組及控制組在0.75 M檸檬酸或酒石酸溶液 (pH 3.5) 中之存活率卻沒有顯著性 (p＞0.05) 差異。10℃-2 h冷震處理提升了S. thermophilus在模擬胃酸中 (pH 2.5、2.8) 之耐受性；但在2%膽鹽溶液中，10℃-2 h冷震菌體及控制組菌體之存活並未有顯著性 (p＞0.05) 之差異。

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「靈芝-豆科」發酵產物之抗氧化活性及其對倉鼠脂質之影響

動脈粥狀硬化所造成的腦血管疾病，心臟病與高血壓疾病分別高居國人十大死因的第二、三及十名。過高的血脂濃度與體內的氧化壓力（導致低密度脂蛋白（LDL）的氧化）是動脈粥狀硬化的肇因。人體天然存在的內源性抗氧化物質會與自由基反應而降低其傷害性，許多體外（in vitro）及離體（ex vivo）實驗亦證實飲食中的抗氧化物質可增強LDL對氧化的抵抗力。靈芝中的多醣體、三萜類等活性成分被證實具有抗氧化及降膽固醇等效果。從豆科植物如黑豆及黃耆中萃取出的異黃酮素，更具有抑制脂質過氧化及延緩低密度脂蛋白氧化的能力。以黑豆及黃耆為部分發酵基質，在發酵過程中微生物的作用可能使抗氧化活性成分如異黃酮或其他類黃酮素的醣苷鍵被分解，成為醣苷配基（aglycone）形式，多醣體亦可能經由發酵所產生酵素的作用，使其降解為較小的分子，增加對水的溶解度與生物活性，而更易為人體所吸收及利用。 本論文研究探討的主題為「靈芝-豆科」發酵產物抗氧化活性及其對血脂之影響，分成三個部分進行探討：(1)探討不同發酵條件之「靈芝-豆科」發酵產物之體外抗氧化活性；(2) 以動物模式探討樣品對倉鼠血脂及抗氧化之影響：(a)動物試驗I：探討靈芝子實體對倉鼠血脂之影響；(b) 動物試驗II：探討「靈芝-豆科」發酵濾液對倉鼠血脂之影響；(c) 動物試驗III：探討探討「靈芝-豆科」發酵濾液乙醇萃出物對倉鼠血脂之影響；(d) 動物試驗IV：探討不同飼料及油脂配方對倉鼠血脂之影響；(3) 探討「靈芝-豆科」發酵濾液中具抗氧化活性之成分。 不同發酵條件之「靈芝-豆科」發酵產物抗氧化活性結果顯示：靈芝發酵濾液去除多醣者，其抑制LDL過氧化能力較佳；發酵溫度對靈芝發酵濾液抑制銅離子誘導人類LDL氧化能力為30℃＞18℃＞24℃；通氣量在發酵溫度為18℃時為0.75 vvm效果最佳，發酵溫度為24℃則以0.25 vvm最佳；接菌濃度比較上可發現在發酵溫度30℃時抑制LDL氧化能力為10%＞1%＞0.1%。整體而言對於抑制LDL氧化能力最佳者為GL-D3去除多醣物(發酵條件為30℃、0.75 vvm)，且抗氧化能力隨著發酵時間而增加。在異黃酮素含量方面，總異黃酮素隨著發酵時間而遞減，不含醣基的異黃酮素於發酵初期略有增加，但在第3天後亦呈遞減狀態，至發酵第11天則檢測不到異黃酮素。在抗氧化活性方面，抗氧化能力與總多酚含量有良好的相關性。 動物試驗I結果顯示，餵食添加10％黑豆或黃耆之飼料皆會增加倉鼠血中HDL-C濃度及肝臟中膽固醇濃度，此外黃耆亦會減少倉鼠肝臟中脂質過氧化物含量；餵食添加8％靈芝子實體之飼料對倉鼠血清及肝臟之膽固醇與三酸甘油酯均無降低之效果，但在血清中對過氧化物含量影響則是與黑豆組、黃耆組及正控制組(probucol)相同，均具有降低倉鼠血清MDA之效果。動物試驗II結果顯示，餵食添加10％靈芝發酵濾液之飼料能降低倉鼠肝臟中膽固醇及血清中MDA含量，但倉鼠之每日攝食量、體重及肝臟中之MDA卻顯著增加。動物試驗III結果顯示，餵食倉鼠含1％靈芝發酵濾液乙醇萃出物之飼料對於誘導高血脂之倉鼠血清及肝臟中膽固醇、三酸甘油酯、氧化遲滯期及過氧化物(MDA)均無降低之效果。 動物試驗IV結果顯示，餵食Purina 5001 rodent chow diet之血清總膽固醇、VLDL、LDL及LDL-C/HDL-C均顯著高於餵食AIN-93M，肝臟中膽固醇含量亦為餵食 Purina 5001 rodent chow diet較高。在以AIN-93M為基礎飼料比較不同油脂飽和程度之影響方面，結果顯示除了餵食添加6％豬油降低倉鼠血中膽固醇外，其餘均無顯著差異；本次研究顯示不同基礎飼料對倉鼠本身的血脂所造成的影響遠大於油脂不飽和程度所造成的影響。 探討靈芝發酵濾液中有效抗氧化成分方面，研究結果顯示pyrogallol及protocatechuic acid為靈芝發酵濾液有效抗氧化成分。Protocatechuic acid在靈芝發酵過程中隨著發酵天數延長而增加，總多酚含量及抗LDL氧化活性亦隨發酵天數延長而增加，顯示protocatechuic acid為靈芝發酵液中主要影響其抗氧化活性成分。

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薏仁麩皮調節過敏免疫反應之研究及其活性成分之分離與鑑定

過敏性疾病是免疫失調所造成的過敏反應，包括有異位性皮膚炎、過敏性鼻炎及氣喘…等。在台灣地區過敏症狀的盛行率逐年增高，除了以藥物立即性的遏止不良過敏反應發生，如何藉由日常飲食養生上來調節免疫力，減少過敏症狀以避免藥物資源的浪費是重要的課題。過敏反應的發生包括早期肥大細胞釋放組織胺等過敏介質，晚期肥大細胞分泌細胞激素及後續巨噬細胞的發炎反應，因此本研究首先探討薏苡籽實乙醇萃取物對老鼠嗜鹼性白血球細胞株RBL-2H3及老鼠巨噬細胞RAW 264.7其抗過敏及抗發炎之功效。 以1 μM A23187誘導肥大細胞RBL-2H3產生過敏反應的實驗中，除了精白薏仁外，薏苡籽實各部位乙醇萃取物皆有效抑制A23187誘導細胞去顆粒化釋放β-hexosaminidase的程度，以薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯層其EC50 為40.8 μg/mL最佳。進一步實驗發現薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯層40~100% EtOAc/Hex極性區分物抑制組織胺釋放的EC50在71~87 μg/mL之間，此外亦可有效抑制細胞分泌IL-4、IL-6及TNF-α，顯示薏仁麩皮不僅抑制細胞去顆粒化，也同時抑制了細胞激素的分泌。薏仁中含有palmitic acid、4-hydroxybenzaldehyde、6-methoxy-3H-benzoxazol、4-hydroxyacetophenone、p-coumaric acid及quercetin等抗過敏物質，可藉由抑制胞內ROS生成，抑制Akt及ERK的磷酸化，降低PKC蛋白質的表現，進而影響肥大細胞的訊息傳遞而達到抗過敏的功效。以1 μg/mL LPS誘導巨噬細胞RAW 264.7產生發炎反應的實驗中，薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯層40~100% EtOAc/Hex極性區分物在50 μg/mL濃度下不影響細胞生存率，可抑制細胞釋放一氧化氮。當濃度在6~30 μg/mL之間，更可有效降低細胞分泌IL-6及TNF-α等發炎性細胞激素的含量，顯示薏仁麩皮具有抗發炎的功效。 利用體外初代細胞培養探究薏仁麩皮萃取物對動物體的免疫調節作用，實驗結果發現薏仁麩皮萃取物可藉由降低IL-6及TNF-α的含量來抑制小鼠腹腔細胞發炎反應。對於小鼠脾臟細胞，薏仁麩皮萃取物則可顯著增加IL-2的含量，並降低IL-4及IL-5的細胞激素分泌，推測薏仁麩皮萃取物可調節Th1/Th2免疫反應。進一步確認薏仁麩皮萃取物的抗過敏活性，實驗利用OVA致敏鼠的模式，以管餵薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯層區分物進行動物實驗。結果顯示，薏仁麩皮樣品可顯著降低動物體內特異性IgE抗體的生成，並藉由提升IFN-γ且顯著減少IL-4及IL-5的分泌，達到調節Th1/Th2免疫反應之功效，進而減緩動物體內過敏症狀。 為探究薏仁麩皮中可能之抗過敏成分，進一步針對薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯層40~100% EtOAc/Hex沖提物進行分離純化，結果由分離純化出22個化合物，其中有16個化合物為首次自薏苡分離純化而得，包括12個類黃酮tangeretin (FL1)、new flavonoid (FL2)、formononetin (FL3)、davidigenin (FL4)、homoeriodictyol (FL5)、hesperetin (FL6)、isoliquiritigenin (FL8)、liquiritigenin (FL9)、3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone (FL10)、chrysoeriol (FL11)、3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone (FL12)和3,5,7,4'-tetramethoxyflavone (FL13)；2個色酮類5-hydroxy-7-methoxychromone (C1)、5,7-dihydroxychromone (C2)、1個酚酸酯類ethyl ferulate (PE1)及1個固醇類6α-hydroxystigmast-4-en-3-one (S1)。更進一步建立HPLC/MS的系統，以利於分析薏仁中類黃酮類成分。 綜上所述，薏仁麩皮中含有多樣性的類黃酮成分，推測這類化合物在過敏免疫反應的調節，抑制早期肥大細胞的過敏反應，減緩晚期巨噬細胞的發炎反應，及調節動物體內Th1/Th2免疫反應上可能扮演著功能性成分。綜合以上結果，薏仁麩皮乙醇萃取物具有調節免疫並減緩過敏的保健功效。

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薏仁麩皮乙醇萃取物乙酸乙酯區分層對於人類乳癌細胞生長之影響

乳癌的發生率在台灣女性好發癌症中已躍居第一位，乳癌的發生跟雌二醇(estradiol，E2)的表現有很大的關係，而植物固醇(phytosterol)具有調節體內雌激素表現與抑制癌細胞增生的功效。故本研究擬探討薏仁麩皮乙醇萃取物對於人類乳癌細胞增生的影響，並比較不同樣品中植物固醇的含量與其抑制乳癌細胞增生作用是否相關。以開放式管柱層析配合不同溶劑沖提將薏仁麩皮乙醇萃取物依極性分成四個部分，並對不同乳癌細胞進行生長抑制分析。實驗結果顯示，低極性的部分對於乳癌細胞MCF-7有最佳的抑制效果，且對於正常乳腺上皮細胞H184B5F5/M10無顯著毒性；以流式細胞儀分析細胞週期的變化，發現乳癌細胞MCF-7經100 μg/ml濃度的萃取物分別處理不同時間後， G0/G1 phase的比例由40％上升至59％，在處理16小時後則有顯著的subG1 phase出現；以annexinV-PI雙染法分析，結果顯示癌細胞經處理6小時後，早期凋亡的癌細胞比例由5.4％ 上升至51％；以西方轉漬法分析p53與p21蛋白的表現，結果發現隨著處理時間增加，萃取物能提高p53與p21的表現；針對各樣品以LC-MS/MS分析其植物固醇的含量，初步發現樣品中campesterol的含量與對乳癌細胞的抑制效果呈現正相關，推測薏仁麩皮萃取物中的植物固醇可能是抑制乳癌細胞增生的主要活性成分之一。