國立臺灣大學食品科技研究所學位論文/Institute of Food Science and Technology
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自噬性細胞死亡（Autophagic cell death, Ⅱ型細胞程序性死亡）和細胞凋亡（Apoptosis , I型細胞程序性死亡）是細胞死亡的兩種不同形式。他們皆為細胞反應外界的壓力所產生的變化，在某些狀況下，自噬(Autophagy)為構成細胞對外在環境的適應，但在癌症抑制上，其又構成了另一種細胞死亡途徑的關係。薑(Ginger)是亞洲國家使用已久天然食品與藥草，在薑萃取物中，薑酮醇(Gingerol)、薑烯酚(Shogaol)是主要的活性成分，其中6-shogaol具有良好之抗發炎活性、抗細菌和抗肝毒性，此外，6-shogaol能誘導肝癌細胞透過Akt-PI3K路徑促使其產生自噬、也被證明能誘導人類大腸癌細胞之凋亡。但有關6-shogaol對人類大腸直腸癌細胞HT-29的凋亡和自噬間之研究仍相當有限，因此，本研究以HT-29大腸直腸癌細胞模式探討6-shogaol對兩者死亡形式的關係。過去，本實驗室的研究已經證實，6-shogaol透過調節粒線體膜電位下降，可有效誘導HT-29凋亡。但對於6-shogaol的和caspase活性，凋亡和自噬性細胞死亡之間的發展尚不清楚。故我們假設6-shogaol抑制HT-29的細胞生長是通過自噬與凋亡。藉由檢測自噬相關的每一個階段的發展模式來討論其關係性。結果顯示，在存活率試驗中，6-shogaol在24小時內不呈現劑量效應，接著以流式細胞儀分析autophagososome和 autolysosome的活性、細胞膜外翻(Annexin-V)、caspase3/7的表現與DNA片斷化的情況，並以共軛焦顯微鏡證明autophagososome的形成，發現自噬和凋亡的發生原來是決定於不同的劑量與時間點，以18小時為分界，是兩者細胞死亡型式的交接點且並行不悖，並在低濃度（20 μM）下可以維持較長的自噬效應，高濃度下（80 μM）自噬性死亡和細胞凋亡皆大量表現。此外，6-shogaol對於細胞週期G2/M有阻滯的作用，可推測6-shogaol藉由G2/M阻滯、影響細胞的有絲分裂而促進細胞死亡。
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大腸直腸癌(colorectal cancer)在全球癌症致死原因中位居第二，其發生原因與飲食、生活習慣、遺傳等因素相關。腸道的癌化機制是一系列基因突變累積的結果，包含adenomatous polyposis coli (APC)突變使β-catenin表現增加，導致細胞異常增生，產生腺瘤；K-ras的異常表現，使不正常的細胞持續生長，腺瘤加大；p53的突變使異常細胞不會凋亡，最後形成惡性腫瘤。 過去研究顯示，植物內所含的植化素(phytochemicals)具有抑制癌症發生的效果。本研究參考相關文獻，選出六種具有抑制大腸直腸癌潛力的植化素，包括epigallocatechin gallate (EGCG)、sulforaphane (SFN)、phenethyl isothiocyanate (PEITC)、6-shogaol (SG)、ursolic acid (UA)與resveratrol (RV)，分別對大腸癌細胞株HT-29及HCT 116進行處理，分析這些植化素對APC、β-catenin、p53等蛋白表現的影響，篩選出能顯著影響上述蛋白表現之植化素，繼而進行代謝體學分析，以了解其作用機制。 結果顯示，resveratrol可有效抑制β-catenin增加、促進wild-type p53表現，並使mutant p53降低，效果最佳。接著進行代謝體分析後發現，resveratrol可抑制大腸癌細胞HT-29及HCT 116之taurine產生、降低HT-29之hypoxanthine與5’-methylthioadensine並提高其CMP；在HCT 116中，resveratrol可提升purine metabolism、TCA cycle及胺基酸相關代謝產物。由此推測，resveratrol可經由對wild-type p53與mutant p53之調控來影響purine metabolism及促進葡萄糖進入TCA cycle產生能量，減少其醣解作用發生，進而達到抑制癌細胞生長之效果。
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憂鬱症是精神疾病中盛行率極高的情感性疾病，並且根據 WHO 公佈的統計顯示， 全球憂鬱症患者逐年攀升，並且將會在2020年成為精神疾病之首。由於目前抗憂鬱劑治療方式會帶給許多病人嚴重的副作用，例如焦慮，腸胃問題，以及性功能衰減。因此如何預防憂鬱症是個重要的課題。本研究應用中藥食療預防醫學探討天麻水萃物對大鼠情感相關腦組織之影響，如前額葉皮質，海馬迴，以及紋狀體。本研究以管餵的方式將0.5 g/kg BW劑量之天麻水萃物 (WGE) 給予 Sprangue-Dawley大鼠，每日一次並為期連續21天，並進一步利用強迫游泳試驗(FST) 來誘導憂鬱症。研究結果顯示，天麻水萃物試驗組 (WGE) 的大鼠在FST 中比控制組 (NE) 的老鼠取得有顯著性差異較低的不活動時間，顯示 FST有成功的誘導大鼠憂鬱症行為。在 21天試驗期結束後，將大鼠犧牲，並取得前額葉皮質，海馬迴，紋狀體等憂鬱症相關之大腦區域組織，接著萃取total mRNA. 進一步利用微陣列分析來探討可能的天麻抗憂鬱機制，並運用即時聚合酶鏈式反應來驗證實驗結果。微陣列分析結果顯示在大鼠前額葉皮質以及海馬迴中，axongenesis, neurogenesis, nervous system development, 以及多巴胺分泌 (dopamine secretion) 為最有可能的機制，根據與資料庫的資料比對後取得的p-value值大小排列，最有可能的機制為最小的數值。然而紋狀體的微陣列分析結果並沒有顯式與憂鬱症有關的機制。即時聚合酶鏈式反應實驗結果驗證了WGE確實有顯著性的提升與神經可塑性 (neuroplasticity) 相關的基因表現量， 如Map1b,RhoA, profilin-1, 以及CRMP2 (p < 0.05).因此，神經可塑性為天麻水萃物之可能的抗憂鬱機制。本研究結果可為未來同一試驗模式但不同體系之研究做為參考，並為未來抗憂鬱製藥的研究有所貢獻，尤其是中藥天麻在基因體學中之抗憂鬱研究領域。
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十字花科植物廣受大家喜愛，其所含有的二次代謝產物－硫代葡萄糖苷，已被許多文獻證實具有許多生理活性，如抑制腫瘤形成、抗氧化與提高人體中解毒酵素的活性等。本研究以十字花科中之青花菜為材料，希望以植物組織培養的方式來生產硫代葡萄糖苷。實驗分三階段進行。第一階段乃尋找適合青花菜形成癒傷組織的培養基。在嘗試不同濃度與種類的植物荷爾蒙後，發現以MS培養基添加1 mg/ L 2,4-D與0.5 mg/ L的BA有最好的誘導效果，成功誘導的癒傷組織高達80%。第二階段進行搖瓶培養，發現在七天後，glucobrassicin會增加。第三階段則以發酵槽放大培養，結果顯示硫代葡萄糖苷在癒傷組織內含量較多，僅有少量硫代葡萄糖苷會釋放到培養液中。其中又以氣舉式發酵槽通入5 %二氧化碳下，其癒傷組織中的硫代葡萄糖苷含量最多。而利用發酵槽培養癒傷組織，其水萃液(1 g/ 30 mL H2O)抗氧化能力又以氣舉式發酵槽不通入二氧化碳最好，其也含有較高的酚類物質。在癒傷組織中硫代葡萄糖苷之HPLC分析圖譜中，在滯留時間為27分鐘有一明顯波峰，經由質譜儀分析後，推測其結構可能為4-Methoxyglucobrassicin。
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子宮內膜癌在歐美是婦癌的首位，而台灣近年來其發病率呈現上升趨勢，若就女性生殖道癌症中發生率則是排名第三位，僅次於子宮頸癌及卵巢癌。過去研究指出薏苡籽實對於抗突變與抑制腫瘤具有正面的調節作用。本研究目的為將薏苡籽實萃取物分別給予子宮內膜癌細胞 HEC-1A與 RL95-2，評估其抑制活性並篩選有效次區分物指標化合物，並進一步探討其作用機制。結果顯示，薏苡種皮乙醇萃取物 (adlay testa ethanolic extract, ATE) 具顯著抑制效果，其中以乙酸乙酯區分層 (ethyl acetate fraction of ATE, ATE-EA) 活性最佳，其次區分物中以 ATE-EA-C、D、E、F 抑制活性較明顯。進一步利用各種化學組成分析方法定性ATE-EA後所得的結果做活性分析，發現成分中的酚類化合物、黃酮類化合物、固醇類化合物以及脂肪酸類化合物皆具有抑制癌細胞生長的效果；根據流式細胞儀分析以及西方轉漬法的實驗結果，ATE-EA可促使子宮內膜癌細胞走向凋亡，經由加入抑制劑的MTT assay結果顯示ATE-EA抑制RL95-2生長是走PI3K/PTEN/AKT signaling pathway以及MAPK / p38 signalling pathway；另外透過 wound-healing assay 得知ATE-EA具有降低 HEC-1A 轉移的功效。因此，本研究的結果顯示薏苡種皮乙醇萃取物具有抑制子宮內膜癌細胞生長的效果。
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結腸直腸癌 (colorectal cancer, CRC) 是目前常見的癌症，約 70% 結腸直腸 癌與飲食習慣相關。益生菌及益生質具有維持人體腸道內正常微生物菌相、減緩乳糖不耐症、降低膽固醇、調節免疫系統、抗腫瘤及抗致突變等諸多生理功能，有研究指出部分原因可能與其所產之胞外多醣 (exopolysaccharides, EPS) 有關。 本研究以五株乳酸桿菌胞外多醣為為材料進行試驗，首先探討其對雙叉桿菌的助生性效果，接著利用致突變劑 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) 誘導人類腸道上 皮細胞 Int-407 產生細胞及基因毒性，評估降低細胞及基因毒性的能力，並探討抗細胞毒性的機制。最後以 MTT assay 及流式細胞儀分析其抑制人類結腸癌細 胞 HT-29 增生及細胞週期阻滯的能力。結果顯示，乳酸桿菌胞外多醣對雙叉桿菌皆有助生性效果，以 L. acidophilus BCRC 14079 胞外多醣效果最佳。在抗細胞毒性方面，五株乳酸桿菌胞外多醣皆可顯著提高經誘導損傷後 Int-407 的細胞存活率，但在不同濃度下有最佳的效果。利用分段式預反應探討其抗細胞毒性機制，結果顯示主要為阻斷效應 (blocking effects) 及生物抗細胞毒性效應 (bioanticytotoxic effects)。由彗星電泳結果顯示，乳酸桿菌胞外多醣處理組 DNA 拖尾程度顯著小於 4NQO 組。在抑制人類結腸癌細胞 HT-29 增生方面，隨作用時間增加，細胞存活率越低，且在 48 小時作用下呈現濃度效應，以 200 ug/mL 之 L. casei 01 胞外多醣效果最佳，抑制率為 31.2%。流式細胞儀分析結果顯示，乳酸桿菌胞外多醣能使 HT-29 細胞週期停滯於 G0/G1 phase，並顯著增加 sub-G1 phase，誘導細胞走向凋亡。本研究結果顯示，乳酸桿菌胞外多醣具有助生效果，也能有效的保護腸道細胞降低損傷，抑制癌細胞的增生。
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阿茲海默症 (Alzheimer’s disease , AD) 是一漸進式神經退化性疾病，也是最常見的一種失智症。病徵包括記憶力喪失、理解及語言能力下降、行走及吞嚥困難，最終將喪失獨立生活的能力。由神經病理學來看，AD患者腦中會形成類澱粉斑塊( amyloid plaque ) 及神經糾結 ( neurofibrillary tangles ) 的沉積。近年來許多研究指出，分子小而具水溶性的β-類澱粉胜肽寡聚合物 ( Aβ1-42 oligomers ) 是導致AD的主因。由於目前並沒有根治AD的方法，因此本研究以「Aβ-42寡聚合物誘發神經細胞毒性」為模式，希望能研究出有效保護神經細胞抗Aβ-42寡聚合物毒性進而預防AD的天然中草藥。根據本研究室過去實驗指出，當歸 ( Anglica sinensis ) 甲醇萃出物 ( As-M ) 在dPC 12細胞模式具有抗Aβ1-40寡聚合物毒性之效果。文獻指出當歸中所含主要的活性成分Z-藳本內酯 ( Z-ligustilide, Z-LIG ) 以及阿魏酸 ( Ferulic acid, FA ) 皆具有保護神經細胞的效果。因此本實驗一方面製備純化的Z-LIG，並以HPLC分析當歸甲醇萃出物( As-M )中Z-LIG及FA含量，同時以初代大鼠腦皮質細胞為模式，以As-M、Z-LIG和FA，等樣品進行抗Aβ-42寡聚合物毒性效果之探討，並研究其可能機制。實驗結果顯示，抑制Aβ-42寡聚合物毒性效果最好的樣品是75 μM FA，其抑制率為28.6%；其次是25 μM Z-LIG，抑制率為24.0%；而As-M在10 ppm時保護效果最好，但與Aβ-42寡聚合物處理組相比沒有顯著差異。為探討兩者是否具協同作用，進一步將Z-LIG與FA混和後，進行抑制Aβ1-42寡聚合物毒性之試驗，結果顯示兩者不具協同作用。續以Aggrregated human Aβ ELISA kit分析有效樣品是否對Aβ1-42寡聚合物的產生有抑制效果，發現Z-LIG可有效降低(51 )% Aβ1-42寡聚合物的產生，而FA則可降低23.3% ，與Aβ1-42寡聚合物組相比沒有顯著差異。雖Z-LIG可有效降低(51 )% Aβ1-42寡聚合物的產生，但在高劑量下對保護神經細胞抗Aβ1-42寡聚合物毒性之效果較差，推測由於在培養液中溶解度甚低，致使無法有效保護神經細胞；而FA雖能有效抗Aβ1-42寡聚合物毒性，但卻無法有效減少Aβ1-42寡聚合物之產生，推測其對神經細胞之保護效果，可能來自其他機制。
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植物固醇可分為自由態、steryl ferulate、酯化態、醣苷態及酯化醣苷態5種。傳統分析植物固醇的方法具有許多缺陷，如酸水解造成的固醇降解或異構化。本實驗目的即為建立以液相層析/大氣壓力化學游離法串聯質譜 (liquid chromato- graphy/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry, LC/APCI-MS) 及液相層析-蒸發光散射偵測器 (liquid chromatography-evaporative light scattering detector, LC-ELSD) 同步分析不同型態植物固醇的方法。以 NH2固相萃取管淨化樣品可去除三酸甘油酯及酯化態固醇，並分離出植物固醇，以 LC/APCI-MS 分析自由態植物固醇的添加回收率，介於83.69-106.89 %；以固相萃取法取代傳統水解法可避免固醇分子產生異構化並保持完整的植物固醇型態。使用逆相液相層析串聯質譜可同步分析自由態、steryl ferulate、醣苷態及酯化醣苷態固醇的個別分子，植物固醇的最強特徵離子皆為其固醇基團脫去一分子水的訊號，自由態固醇偵測極限介於5-50 ng/mL。另以正相液相層析-蒸發光散射偵測器分析，樣品可不經前處理直接分析，正相層析管柱可將植物固醇依結構上不同結合態分離，並定量該型態固醇的總量。但由於酯化態固醇與蠟酯無法分離，仍無法對其定量；不同植物固醇偵測極限介於0.5-5 μg/mL。分析糙米及豆類樣品結果顯示 LC-MS 及 LC- ELSD 的結果具有差異，由於結合態固醇缺乏單一標準品而無法以 LC-MS 準確定量，而 ELSD 對於結構相似的固醇分子感應值較相同，因此定量的數值應較 MS 的結果準確。樣品中的固醇組成以avenasterol、campesterol、stigmasterol 及 β-sitosterol 為主，糙米中主要含有自由態固醇及 steryl ferulate (γ-oryzanol)，醣苷態及酯化醣苷態的含量較低；豆類樣品中含有自由態固醇及高量的酯化醣苷態固醇，但皆不含有 steryl ferulate。樣品中黃豆及黑豆的醣苷態固醇含量較高。
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腦部若缺乏血液供應會造成神經細胞損傷並引起不同的疾病如：急性的中風或慢性的缺血性失智症。酚酸是天然植物中常見的抗氧化物質，莓果類的水果即富含許多不同的天然酚酸。許多文獻指出酚酸類物質可以幫助不同細胞對抗不同的逆境如I)氧化損傷 II)缺乏營養素III)高醣環境 等等。目前有關酚酸對抗缺血性神經細胞損傷的研究尚未被廣泛探討，本研究目的係探討常見水果中所含天然酚酸改善缺血性神經損傷的效果。 實驗先以小鼠神經瘤為細胞株 (neuro-2a)，培養於缺氧、缺葡萄糖的環境來摹仿真實情況下的動物腦缺血性損傷，並以MTT assay 來測定小鼠神經纖維母細胞瘤的存活率，評估9種天然酚酸改善小鼠神經纖維母細胞瘤缺血性損傷之效果。實驗的9種酚酸裡面以10 μM ρ-coumaric acid 和 1 μM Chlorogenic acid處理48小時相較於對照組，分別可以顯著提升14.97%和9.49%細胞存活率。許多文獻指出神經細胞在缺乏必須養分下可透過自噬作用走向死亡。本研究結果顯示10 μM ρ-coumaric acid 和1 μM Chlorogenic acid處理48小時後可以顯著改善小鼠神經纖維母細胞瘤自噬作用。文獻指出，細胞自噬作用跟細胞內鈣離子濃度有密切關係。本實驗結果發現，缺血性損傷之小鼠神經纖維母細胞瘤相較於正常細胞，其細胞內鈣離子濃度顯著性較低 (p<0.05)，而缺血性損傷小鼠神經纖維母細胞瘤以 10 μM ρ-coumaric acid和1 μM Chlorogenic acid處理48小時可以顯著提升胞內鈣離子濃度。由上述結果推測，苺果類果汁中含有的ρ-coumaric acid和 Chlorogenic acid可以提升細胞內鈣離子濃度，增加Calpain分泌，而達到減少神經細胞自噬作用，並改善缺血性失智之發展。
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肝癌為近年來國人癌症死因中第二位，目前常用的治療方法有手術切除、肝臟移植、栓塞治療以及化學藥物治療等，但皆有其侷限性或副作用；因此，由天然物開發有效之抗癌藥物已成為重要的課題。鴻喜菇 (Hypsizigus marmoreus) 為低熱量、低脂肪且營養價值高的食用菇，目前研究結果顯示其具有抗腫瘤、抗真菌、抗氧化等功能。本研究將鴻喜菇以 40~80% 飽和度之硫酸銨沉澱得蛋白質粗萃物，再以陰離子交換樹脂 DEAE-Sepharose CL-6B 經連續鹽梯度或階梯鹽梯度溶離收集樣品。以 0~1 M連續鹽梯度所得樣品 HM-3 及階梯梯度 0.2 與 0.4 M 鹽濃度溶離之樣品 ( fraction Ⅰ、Ⅱ) 對 HepG2 進行生長抑制測試，經 50 µg/ml 之 HM-3 處理 12 及 24 小時得到的生長抑制率分別為 87.41% 及 88.25%，且生長抑制具有濃度效應。以 50 µg/ml 之 fraction Ⅰ 對 HepG2 處理 12 及 24 hr 的抑制率分別為 24.41% 與 19.44%，而 fraction Ⅱ 則無抑制效果。階梯梯度樣品中以 fraction Ⅰ 抑制效果為佳，但仍較 HM-3 差，故後續探討生長抑制機制皆以 HM-3 為樣品。由流式細胞儀分析細胞週期結果顯示，以 HM-3 處理 24小時，會使 HepG2 出現細胞週期停滯 (cell cycle arrest)，當濃度由 0 提升至 200 µg/ml，G1 phase 比例由 54.35% 提高至 69.08%，但並無細胞凋亡之現象。以瓊脂糖膠體電泳檢測 DNA 完整性，也未觀察到細胞凋亡特徵之ㄧ的 DNA 片段化。利用西方墨點法檢測 G1 細胞週期停滯相關蛋白 p53、p21、p27、cyclin A2、cyclin D1、cyclin E1 及 CDK2 之表現，發現隨處理濃度提高，p53 及 p21 表現量皆有增加的現象，p21 表現量與控制組相比具顯著差異。cyclin E1 表現量與控制組相比有顯著下降的現象，而 p27、cyclin A2、cyclin D1 及 CDK2 表現量則無明顯變化。根據以上結果推測，HM-3 能抑制 HepG2 生長，並可能透過活化 p53 與 p21 而抑制 cyclin E1 之表現，使其細胞週期停留在 G1 phase。
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