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利用PCS生物反應器最適化生產紫芝胞外多醣與其抗發炎能力之探討

Ganoderma formosanum又名紫芝，屬於臺灣特有的靈芝品種，近年來已有研究證實其深層培養液所分離出的胞外多醣體具有免疫調節與抗腫瘤的功效；為提高紫芝胞外多醣體的產量，本篇研究以固定化培養的方式- plastic composite support (PCS) 生物反應器作為量產工具，並以抗發炎能力來評估多醣經量產後的活性影響。經最適化結果發現，SF+在四種 (SF+, SY+, SB+ and SR+) PCS中能最有效促進紫芝生長與胞外多醣體的生產；結合培養基碳源的調整和SF+固定化系統的生產，在兩階段醱酵時紫芝胞外多醣的產量已顯著得到提升 ( p < 0.05 )，且連續式生產的實驗中也觀察到重複利用菌體醱酵的情形可達五次之多，如此也反應了PCS生物反應器比起傳統的懸浮培養具有生產週期短、操作便利以及成本低的優勢。在評估多醣體生物活性的實驗中，我們發現經固定化生產的胞外多醣體清除自由基的半抑制濃度較懸浮培養低，且兩者在相同處理濃度下 (125 μg/mL) 抑制RAW 264.7產生發炎因子nitric oxide ( NO ) 的能力亦沒有顯著差異。從單糖組成和β-1,3-glucan的分析結果我們推測其活性來源可能為靈芝活性研究中報導較多的β-glucan和fucose-enriched polysaccharides。

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儲存期間啤酒花萃取物之抗氧化及對痤瘡桿菌抗菌之影響

啤酒花廣泛用於啤酒釀造過程中賦予啤酒苦味以及特殊香氣。研究指出啤酒花中苦味酸化合物葎草酮 (humulone)、蛇麻酮 (lupulone)，以及多酚類化合物等活性成分，具有抗菌、抗發炎、抗氧化、抑制癌細胞增生等功效。尋常性痤瘡 (acnevulgaris) 俗稱青春痘，是一種常見的皮膚疾病，而痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, P. acnes) 對尋常性痤瘡形成扮演著相當重要的角色。啤酒花中活性成分的穩定性相當重要，但這些成分易受光、溫度、氧氣的影響而劣化。為促使啤酒花能獲得更廣泛之應用，故本研究欲探討以不同酒精濃度 (55%、75%、95%) 萃取之啤酒花萃取物 (hops ethanol extracts,HEE)，及以超臨界流體萃取之啤酒花浸膏對痤瘡桿菌之抑菌效果，並探討啤酒花萃取物在儲存期間之抗痤瘡桿菌與抗氧化活性的變化，萃取物分別儲存於室溫 (25°C) 及冷藏 (4°C) 環境下 3 個月，藉此評估啤酒花應用在皮膚保健產品上的潛力。研究結果顯示，不同啤酒花萃取物對痤瘡桿菌皆有良好抑菌及殺菌效果，且以啤酒花浸膏殺菌效果最佳，抑制 P. acnes 生長的最小抑制濃度 (MIC) 和最小殺菌濃度 (MBC) 為 2 μg/ml 和 4 μg/ml。而儲存試驗結果顯示，經過 3 個月儲藏後，95%酒精萃取之啤酒花萃取物及啤酒花浸膏之抗菌及抗氧化活性較穩定，抗氧化力分別下降 0.06%、15.28%，而 55%酒精萃取之啤酒花萃取物，抗氧化力下降 38.43%，其抗菌及抗氧化活性有明顯下降的現象 (P < 0.05)，透過低溫儲存可減緩其下降趨勢。因此，未來欲利用啤酒花進行產品開發，可選擇較安定的啤酒花浸膏或 95%啤酒花酒精萃取物來進行，尚需注意其儲存環境，以確保其效用。

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白皮杉醇抑制小鼠肥胖的功效及相關分子機制的探討

肥胖已是全球性的健康問題，過多的脂肪堆積會導致許多疾病的發生，包括心血管疾病、非酒精性脂肪肝、癌症、第二型糖尿病、中風、骨關節炎等，如何預防肥胖或是減重已成為近年來科學家研究的重要議題之一。白皮杉醇 (Piceatannol) 是白藜蘆醇 (Resveratrol) 的類似物，已有多篇研究指出其生理功效，包含抗癌、抗發炎及降低血糖等。在細胞實驗中，白皮杉醇能有效減少3T3-L1細胞中的脂肪堆積，並抑制細胞擴增期 (Mitotic clonal expansion, MCE)，但目前白皮杉醇在動物體內的抗肥胖效果還未被討論及研究，因此本實驗目的為評估白皮杉醇在動物模式中抗肥胖、脂肪肝及其調節機制之探討。本實驗中，將40隻五週齡雄性C57BL/6小鼠分成5組，分別是正常飲食 (n=8)、高脂飲食 (45% energy from fat, n=8)、高脂飲食混入0.1% Resveratrol (n=8)、高脂飲食混入0.1% Piceatannol (n=8) 和高脂飲食混入0.25% Piceatannol (n=8)，自由攝食飼養18周後犧牲。結果顯示0.1% 和0.25% piceatannol組能顯著的降低小鼠的體重並呈現劑量效應，且不影響攝食量。血液中總膽固醇、血糖及LDL/HDL ratio也有顯著性的降低。在脂肪組織方面，0.1% 和0.25% Piceatannol組能顯著降低性腺脂肪和腹膜後脂肪重量，性腺脂肪切片顯示其脂肪細胞大小也有顯著性的下降。飼料添加Piceatannol組和高脂飲食組相比能顯著降低肝臟和脾臟重量，由肝臟切片也可看出脂肪空泡的數量和大小減少。Piceatannol透過增加pAMPK的表現量降低脂肪細胞分化轉錄因子C/EBPα和PPARγ，並影響pACC和FAS的表現量，減少脂肪酸的形成，進而減少三酸甘油酯的合成。綜合上述結果，Piceatannol在小鼠模式中能改善高脂飼料誘導之肥胖，減少體脂肪及脂肪肝，具有開發成不易形成體脂肪之保健食品的潛力。

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奈米�次微米靈芝懸浮液多醣區分物對巨噬細胞活化之影響

靈芝多醣的生理功能包含調節免疫、抗腫瘤等，最主要的活性多醣為 (1→3, 1→6)-β-D-葡聚醣。已有研究證實，利用濕式介質研磨（Media milling）製備奈米�次微米靈芝懸浮液所得多醣、蛋白質與 (1,3)-β-D-葡聚醣含量大於傳統熱水萃取組，但兩者(1,3)-β-D-葡聚醣結構鑑定結果差異大。因此，本研究分離純化出奈米�次微米靈芝懸浮液多醣區分物（Polysaccharide fractions of nano/submicron Ganoderma suspensions），並與巨噬細胞株（RAW 264.7）進行共培養，探討不同區分物對免疫反應之影響，進一步對有效活化巨噬細胞之多醣區分物做結構鑑定與組成分析。 本研究中，新鮮松杉靈芝子實體經介質研磨3小時後，樣品粒數粒徑約99.9%小於1 μm，且約有63.9%的粒子粒徑小於0.1 μm。以20%、40%、60%、80%酒精沉降獲得粗多醣F20、F40、F60、F80，總多醣、總 (1,3)-β-D-葡聚醣含量皆以F80最高，而總蛋白質以F60最高。每一組粗多醣經陰離子交換層析分離可得Fx-1（含醣）與Fx-2（含醣、蛋白質）兩組區分，總共八組多醣區分物F20-1、F20-2、F40-1、F40-2、F60-1、F60-2、F80-1、F80-2。於細胞存活率試驗結果除了F80-1存活率降至71%至79%外，其餘七組區分物皆無細胞毒性，且區分物F20-1、F40-1、F60-1有利於巨噬細胞生長；一氧化氮與細胞激素TNF-α試驗結果，於樣品濃度25 μg/mL時，F40-2為最有效的一組。多醣區分物以膠體過濾層析法所得分子量分布範圍介於2.9 kDa與126.2 kDa之間，而細胞試驗結果最有效的F40-2分子量範圍介於9.3 kDa與113.7 kDa之間。後續利用高效陰離子層析系統鑑定F40-2單醣組成以葡萄糖（68.2%）、葡萄糖醛酸（15.1%）為主，以及其 (1,3; 1,6)-β-D-葡聚醣分支度為0.27。

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透過包埋技術提升EGCG的消化穩定性並改善大腸直腸癌細胞對其吸收能力

EGCG是茶葉中含量最豐富的兒茶素，具有改善肥胖和代謝症候群的能力，而最近的研究顯示EGCG還具有抑制大腸直腸癌增生以及調降免疫抑制酵素indoleamine 2, 3-dioxygenase(IDO)表現的能力，因此被認為具有應用在癌症免疫療法上的潛力。然而EGCG在腸道的環境中會被快速的氧化成巨分子或是被微生物代謝成小分子，所以難以抵達大腸並被直腸癌細胞吸收。為了改善其消化穩定性，本研究選用微脂體包埋的方式來減少周圍環境對EGCG影響，另外本研究希望作為藥物載體的微脂體能提升癌細胞對EGCG的吸收能力，所以將利用細胞癌化過程中會改變表面電位以及增加胞吞作用的兩個特性，探討帶有不同表面電位以及流動性的微脂體對癌細胞的影響。然而使用微脂體作為載體時，需要注意腸道中的酯解酶會使藥物過早釋出，而本研究將使用溶解度會隨酸鹼值變化的聚合物來包埋微脂體，以避免藥物載體與酵素的接觸。在EGCG吸收率的實驗結果顯示，微脂體能提高癌細胞對EGCG的吸收能力，流動相的微脂體其藥物吸收率顯著高於膠體相，當微脂體帶有正表面電位時，其藥物吸收率高於帶負電以及中性表面電位，且當表面電位越高時其藥物吸收率越好。在物理性質上，流動相微脂體具有較高的包覆效率以及較小的平均粒徑，而在濕式的儲存條件中，各式微脂體均無法防止EGCG擴散出去，但大致能維持住表面電位的穩定性，而幾丁聚醣包覆的微脂體是例外。在包材模擬消化的過程中，發現同時有溶解度隨酸鹼值變化以及緩慢釋放特性的包材較能在模擬大腸消化的後期完全溶解，具有將藥物控制釋放在大腸部位的潛力。

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以反應曲面法探討增加含蜜糖中Policosanol含量及降低Acrylamide含量之製程

含蜜糖(non-centrifugal sugar)一般指甘蔗汁經蒸發濃縮，且未離心所製成之產品。甘蔗蠟是存在於甘蔗莖上的白色粉狀物質，於榨汁過程會有部分進入甘蔗汁中。甘蔗蠟的成分主要包括長鏈醇類、醛類及烷類，其中的長鏈一級醇policosanol具有許多機能性，包含降低血小板凝集、降低血中低密度膽固醇及抑制膽固醇生合成等。由於policosanol水溶性差，一般在含蜜糖產品中含量偏低。但是，若於榨汁時於加入乳化劑處理，則可能藉由提高溶解度使其含量上升。丙烯醯胺 (Acrylamide，AA)於1994年被國際癌症研究中心(IARC)歸類為Group 2A –可能造成人類癌症之物質。食品中丙烯醯胺主要的生成路徑是梅納反應，而甘蔗汁中含有還原糖及天門冬醯胺等前驅物，於含蜜糖製作時經高溫長時間的熬煮，易使產品中丙烯醯胺的含量超過目前國內1000 ppb之指引值。含蜜糖製程中會影響丙烯醯胺生成的參數主要包括食品添加物的離子種類、pH值、加熱終點溫度及持續時間等四項。本研究利用反應曲面法進行多因子探討，期望能找到policosanol含量較高且丙烯醯胺含量合於標準之含蜜糖製程。結果顯示，於甘蔗榨汁時加入乳化劑(TWEEN 80與SPAN 80)，確實能提升含蜜糖成品中policosanol含量，且食品添加物種類對於policosanol含量有顯著差異，其影響為K2CO3 > Na2CO3 > CaO；pH值、終點溫度及持續時間等3個變因的主效應及二次項對於丙烯醯胺含量有顯著的影響。透過變方分析及迴歸分析所建立的二次多項式，藉由缺適性檢定可知其適合描述含蜜糖中policosanol含量(p=0.276)及丙烯醯胺含量(p=0.363)。以色澤作為限制因子，分析policosanol含量最高而丙烯醯胺含量合於標準的含蜜糖最佳化製程，可找到位於不同製程區域的3個最佳點，以其製作的成品能符合前述需求，可作為含蜜糖業者製作產品之製程參考。此外，找到1個可以不使用食品添加物(pH=5.4)及另1個可大量減少製程所需時間(持續時間0分鐘)的最佳點，這2個最佳點雖然在色澤品質上稍有犧牲，但可作為降低成本之製程選擇。

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羅漢果皂苷的製備及純化

羅漢果，學名Siraitia grosvenorii，作為一種傳統中醫藥材常被用來治療感冒、咳嗽、咽喉炎、哮喘、支气管炎和腸胃不適等疾病。各項研究顯示，羅漢果的主要活性成分為一類三萜類皂苷，稱羅漢果皂苷，有如抗氧化、抗病毒、抗癌、抗發炎及抗糖尿病等多種生物活性，在新鮮的羅漢果果實中約占1%，主要以mogroside V的形式存在。羅漢果皂苷還有高甜度、低熱量的特點，可作為天然甜味劑有極強的優勢。由於原料來源及純化技術的限制，過去的研究難以涉及各種羅漢果皂苷間的功效區別。本研究利用不同的方式開發了不同醣基型式羅漢果皂苷之製備方法。用酵母菌Saccharomyces cerevisiae發酵羅漢果果實萃取物，將羅漢果皂苷生物轉化成帶三個醣基的mogroside III E，再以HP-20大孔吸附樹脂管柱對發酵產物進行分離純化，得到純度達54.19%的mogroside III E產品，回收率為72.23%，並成功實現了10倍擴大純化。另外利用化學法將羅漢果萃取物置於2 N鹽酸中在85℃條件下進行酸水解產生皂苷元mogrol，透過乙酸乙酯-水分液萃取法取得純度為13.40%的mogrol產品。本研究中亦利用靈芝菌株ATCC 76537和ATCC 76538將羅漢果皂苷轉化成帶兩個醣基的mogroside II A，進一步延長發酵時間可得到皂苷元mogrol。未來將可利用高純度之各種羅漢果皂苷進行生物利用率等研究。

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天麻水萃物活性成分之抗憂鬱功效及其分子機制的探討

重鬱症 (Major depressive disorder, MDD) 的問題普遍存在於世界各國。目前，全球約有超過 3.5 億的人口患有 MDD，世界衛生組織預測 MDD 在 2030 年將成為全球高負擔疾病的第一名。然而，現今西醫的治療方式，常會帶來許多病人無法接受的副作用，故從自然界尋找替代西藥的素材是迫切急需的課題。天麻 (Gastrodia elata Blume) 是中醫食療中用於作養心安神的藥材，近年研究發現具有改善多種神經退化性疾病的功效。本研究擬以天麻水萃物 (water extract of G. elata Bl, WGE) 之活性成分天麻苷 (gastrodin, GAS) 與天麻苷元 (4-hydroxybenzyl alcohol, HBA) 為素材，探討經強迫游泳試驗 (forced swimming test, FST) 誘導類憂鬱之大鼠是否藉由降低腦部單胺類系統與調節神經細胞骨架重組達到抗憂鬱效果。另外，進一步以 HPLC 建立GAS 分析方法確效以利天麻原料的管理。在動物實驗方面，六週齡 Sprague Dawley (SD) 雄性大鼠經連續 21 天分別管灌餵食 WGE (500 mg/kg bw)、GAS (100 mg/kg bw) 和 HBA (100 mg/kg bw)，以 FST 誘導類憂鬱行為。在行為分析結果顯示 WGE、GAS 和 HBA 皆可顯著降低因絕望所導致的不泳動行為 (immobility time)。腦部單胺類濃度以 HPLC 進行分析，結果顯示三種樣品皆可降低腦部血清素和多巴胺的代謝速率。由於臨床研究發現憂鬱症患者除了與單胺類濃度異常具有高度關聯性外，神經可塑性 (neuronal plasticity) 亦扮演重要角色。因此，本研究後續以西方墨點法探討 WGE、GAS 和 HBA 對神經細胞骨架重組 (neuronal cytoskeletal remodeling) 相關路徑──Slit-Robo 之影響，結果顯示各處理組皆可顯著降低海馬迴中負調節因子 Slit1 和 RhoA 蛋白表現，同時提升正調節因子 CRMP2 和 PFN1 蛋白表現，進而提高神經可塑性。在細胞實驗方面，以人類寡樹突細胞瘤 (Human oligodendroglioma, Hs683) 驗證 Slit-Robo 路徑，此細胞株分別與 WGE (0.5 mg/ml)、GAS (50、100 和 200 μM) 和 HBA (50、100 和 200 μM) 共培養 24 小時，以西方墨點法分析證實 WGE、GAS 和 中高劑量之 HBA (100 和 200 μM) 可直接降低 Slit1 蛋白表現，此現象呼應海馬迴西方墨點法的分析結果。化學分析實驗方面，以 GAS 確效之 HPLC 方法分析加工方式、萃取溶劑、產地及變種對 GAS 含量之差異，結果顯示熱水萃取之烏天麻 (G. elata f. glauca S. Chow) 切片可得到較紅天麻 (G. elata Bl. f. elata) 高的 GAS 含量。綜上所述，本研究證實 GAS 是 WGE 中抗憂鬱活性成分，藉由降低單胺類代謝與調節神經細胞骨架重組達到此功效，並建立 GAS 確效以利往後調節憂鬱情緒保健食品與抗憂鬱用藥開發之原料篩選。

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以生物平台為導向分離中國橄欖水萃物殘渣之抗發炎物質

慢性發炎(Chronic inflammation)為造成許多慢性疾病的主要原因，已知許多中草藥可藉由其具有抗氧化和抗發炎活性的二次代謝物來改善由發炎所造成的慢性疾病。中國橄欖為常見之中藥材及食材，具有優良的抗氧化及肝保護之作用，本研究室過往的研究指出中國橄欖的甲醇萃取物之乙酸乙酯區分層具有很好的抗發炎效果。本次研究目的是以細胞平台為導向，利用不同的化學分離方式，篩選出具有抗發炎效果的活性物質。本研究所使用之生物平台係以本實驗室已建構於RAW 264.7 細胞中可以偵測NF-κB活性及COX-2表現量的兩種與發炎相關之冷光報導基因平台，利用極性沉澱之溶解度分離，發現上清液層具有較好的抗發炎效果，將上清液層以矽膠管柱分離提升次區分層抗發炎效果，顯示在D次區分層具有抗發炎效果，但卻同時伴隨著細胞毒性。將D次區分層再以矽膠管柱分離，發現D-11次區分層具有較佳的抗發炎效果，但同樣也伴隨著細胞毒性，且具有劑量效應，將D-11次區分層以薄層層析(Thin layer chromatography)大量收集具有螢光之條帶，並再以LH-20純化後以核磁共振(nuclear magnetic resonance )鑑定成分，發現主要成分應為Scoparone，HPLC定量結果顯示Scoparone含量的確會隨分離純化層數增加而增加。以發炎平台驗證Scoparone的抗發炎功效，卻發現Scoparone無法抑制由LPS誘導的發炎反應。以回添試驗探討Scoparone與萃取基質的協同作用，結果仍是無提升抗發炎效果，而在單以LPS誘導的發炎模式下，Scoparone對於一氧化氮生成的抑制效果較文獻中以INF-γ/LPS誘導發炎的抑制效果弱，代表Scoparone並非中國橄欖甲醇萃取乙酸乙酯區分層抗發炎功效的主要成分，必須分離純化在D-11次區分層中的其他次要成分方可找出其抗發炎的主要成分。