• 學位論文

異位表現AtAMY3羧端誘導阿拉伯芥葉生理變化之研究

植物白天行光合作用時，會將一部分的光合作用產物合成為暫存性澱粉儲存於葉綠體內，夜間則將澱粉降解供植物體代謝使用。其澱粉合成與降解相關的酵素需在日夜周期間受到適當的調控，以使澱粉得以在日間合成，並於夜間降解。在阿拉伯芥葉綠體中，AtAMY3為唯一的型澱粉水解酶，能夠水解澱粉的-1,4鍵結。過去的研究指出，AtAMY3的蛋白質結構含有不同的功能性區段。其胺端可能含有負調控AtAMY3蛋白質本身的功能，而其羧端則含有水解酵素的活性。先前的研究製造了過量表現AtAMY3胺端及羧端的轉殖株以研究其功能，其中過量表現AtAMY3羧端並帶有黃色螢光蛋白 (EYFP)的轉植株（AMY3C-EY）葉片的澱粉含量大量減少。此轉殖株也表現出許多異常的性狀，包括葉片黃化並帶有網紋、植株矮小、開花期延後等等。本論文希望能探討為何這些性狀會伴隨著AtAMY3羧端的過量表現而產生。 我提出了兩個可能產生這些性狀的假說。第一，這些性狀可能是由AMY3C-EY降解澱粉之後所產生的小分子醣類誘導植物體基因的表現所造成。第二，這些性狀的產生可能是過量表現AMY3羧端後，植物在白天行光合作用卻同時降解澱粉，導致能量過度浪費的結果。為了驗證這些假說，我利用遺傳的方法，在經過輻射照射AMY3C-EY轉殖株所衍生的子代中篩選能夠改變AMY3C-EY親本表現型的突變株，這些植株中的突變基因能夠用以分析假說是否成立。其中的一株突變株，47，植株葉片變綠並且無網紋，實驗結果發現此47中的突變造成喪失合成澱粉所需的AGPase酵素活性，使47無法累積澱粉，因而改變葉片性狀。由47的研究得知，AMY3C-EY葉片黃化並帶有網紋的性狀並非單純緣自於日間暫存性澱粉量的減少，而是澱粉合成後下游代謝改變才造成這些性狀，因此間接支持我所提出的假說。 另一方面，為了研究AMY3C-EY如何改變植物生理，我利用LexA-VP16-ER (XVE)轉錄因子建立了一個可誘導AMY3C-EY表現的系統。藉由塗抹雌二醇(17--estradiol)，可以將XVE轉錄因子限制在特定的植物部位啟動後誘導AMY3C-EY表現。為了研究AMY3C-EY對植物不同發育階段的影響，我將藥劑17--estradiol分別塗在XVE AMY3C-EY轉殖株的頂端分生組織與成熟葉片上。我發現雖然兩種處理都會使相應的植物部位澱粉含量減少，但只有處理藥劑在分生組織後新形成的葉子才會展現黃化及網紋的性狀，已成熟的葉片則不受影響。實驗結果傾向支持AMY3C-EY降解澱粉之後所產生的小分子醣類誘導植物性狀的改變，並且顯示不適當的AtAMY3活性調控只會影響葉綠體的早期發育。至於是否因能量浪費造成性狀改變的假說，我的實驗似乎不完全支持。 綜上所述，我的研究指出AtAMY3羧端的異位表現會影響到葉的早期發育，顯示出適當的AtAMY3水解澱粉活性調控對於阿拉伯芥葉片的重要性。

• 學位論文

鈉鉀ATP酶α次單元EAT-6調控線蟲計劃性細胞凋 亡中細胞外觀變化和磷脂絲氨酸的外翻

計畫性細胞凋亡的主要功能為清除個體中多餘的細胞並維持個體一定的細胞數，對於個體的成長及發育扮演極為重要的角色。細胞凋亡的過程主要可以分為：辨認死細胞、執行死亡、吞噬以及分解等四個步驟。在執行死亡的步驟進行過後，死細胞還會發生磷脂絲氨酸(phosphatidylserine/PS)外翻到細胞膜、細胞型態改變，以及DNA 斷裂降解等現象。過去的研究中發現在線蟲中調控細胞凋亡的基因有數十種，而其中執行死亡的步驟主要是由EGL-1(a BH3-containing protein)，CED-9(Bcl-2)，CED-4(Apaf-1)以及CED-3(Caspase)所調控；然而這四者又是如何被其他基因所調控仍有待研究。本實驗室在過去研究中發現，在eat-6 這個鈉鉀ATP 酶α 次單元異變種胚胎中，細胞屍體(cell corpse)數目有下降的趨勢。本篇論文主要探討EAT-6 是如何造成死細胞數目降低，而我利用死細胞的磷脂絲氨酸會外翻到細胞膜外並與分泌型的Annexin V 結合形成環狀外觀的特性進行分析。實驗結果指出eat-6 的異變種中，沒有死細胞型態但卻會與Annexin V 結合所形成環狀型態有增加的趨勢，這表示eat-6 會影響到死亡細胞型態的形成和脂絲氨酸的外翻。我的遺傳實驗結果也發現，eat-6 會與csk-1 這個非受體性酪氨酸磷酸酶一同參與在核心路徑中去調控細胞凋亡。而另一方面我也發現過度表現EAT-6 則會促進接觸性神經(touch neuron)的細胞凋亡，且eat-6 會作用在egl-1 的上游去促進細胞凋亡的功能且此種功能是需要其運輸離子的功能。以上實驗結果指出eat-6 除了擁有運送鈉鉀離子維持膜電位的功能外，也會影響到死細胞的屍體型態及其脂絲氨酸的外翻。 關鍵字：線蟲、計畫性細胞凋亡、鈉鈉鉀ATP 酶、細胞屍體、外觀型態變、脂絲 氨酸外翻

• 學位論文

果蠅微小核醣核酸-34 的大量表現造成蘑菇體伽馬神經元的神經修剪的缺失

神經退化 (neurodegeneration) 的機制可能是藉由不正常的蛋白質堆積和/或壓力引起的細胞死亡 (cell death) 所造成的。可是，在昆蟲的變態過程中細胞死亡會自然地發生以去調節神經的完整性，透過神經再塑性 (neural remodeling) 的其中一個機制叫作計畫性的細胞死亡 (programmed cell death)。目前尚未清楚神經再塑性和神經退化是否可能經由類似的調控機制去決定神經細胞的命運，另外一個神經再塑性的例子就是果蠅的 gamma 神經元的修剪 (gamma neuron pruning)。 在果蠅的蘑菇體 (mushroom body) 中，包含了三種不同形式的神經元:gamma、alpha'/beta' 和 alpha/beta，它們掌管了果蠅的學習與記憶。當果蠅進入蟲蛹的階段時， gamma神經元的軸突 (axons) 與樹突 (dendrites) 進行修剪與重新生長，以便在成蟲時期產生新的神經網絡，而這個過程是受到TGF-beta 訊息傳遞以及類固醇賀爾蒙：ecdysone訊息傳遞 (TGF-beta signaling and steroid hormone ecdysone signaling) 所調控的。另外，軸突與樹突的修剪只發生在昆蟲的變態過程中並不會發生在成蟲階段。然而，TGF-beta 訊息傳遞以及類固醇賀爾蒙：ecdysone訊息傳遞共同協調 gamma神經元在精確的時間下進行修剪，依然尚未清楚。 先前的一篇研究指出果蠅的miR-34主要表現在果蠅成蟲的腦中，而且對於神經退化性以及壽命 (life span) 的調控扮演著重要的角色，miR-34被指出說它會降低 E74基因的表現量。在miR-34突變之下加速果蠅腦神經退化性的發生，這顯示出miR-34扮演著不可缺少的角色去減少神經細胞的死亡以便延緩腦部老化的現象發生。在這裡，我們將miR-34提早表現在果蠅神經發育時期的蘑菇體，觀察到 gamma 神經元的修剪被抑制住，因而提供了一個線索對於神經修剪與miR-34彼此間可能的分子連結，所以推測神經再塑性與神經退化的之間的連結可能是透過類似的機制而調控的，並且受到miR-34的阻擋。我們進一步證實miR-34 造成EcR-B1的表現量下降，可能是藉由抑制調控EcR-B1表現量的上游基因所導致的結果，再引入 EcR-B1 可以挽救miR-34所產生的神經元修剪的缺陷。miR-34的結合對象包括E74、Yem-alpha和Hr4都不是調控 gamma 神經元的修剪，可是miR-34可能調控TGF-beta 訊息傳遞將成為未來實驗上的一個新的方向。 最後，本篇研究提供了一個新方向，探討果蠅的miRNA在不同時期的表現量有所不同，以去調節神經退化性和神經再塑性之間的平衡。

• 學位論文

dkey參與內質網壓力中去除由人類uORFchop所主導的轉譯抑制

在細胞受到ER stress時，C/EBP homologous protein (CHOP) 對於細胞存活與凋亡扮演重要的角色，而chop mRNA的轉譯主要受到其5’UTR上的upstream open reading frame (uORFchop) 所抑制。當細胞受到ER stress時，chop mRNA會因為uORFchop抑制功能喪失而被轉譯出來。但對於ER stress造成uORFchop喪失轉譯抑制能力的分子機制仍不清楚。本實驗室利用由CMV promoter驅動下游帶有人類uORFchop (huORFchop)及綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP) cDNA之基因構築的轉殖斑馬魚品系huORFZ當材料，因為當它受到ER stress時，便會引發huORFchop功能喪失而促使GFP表現。我們利用雷射顯微切割器(Laser microdissection) 的方式收集逆境後表現於huORFZ的GFP-(+) 細胞，接著以GFP-(-) 細胞作為比較基礎，建立microarray資料庫。當中，我們篩選到一個A值為7.2 (A值大於7表示可信度高) 及M值為2.4 (M值大於0表示強度高)的dkey基因。從全胚胎原位雜交染色(WISH)觀察斑馬魚96 hpf胚胎，發現內生性dkey mRNA在腦部與脊隨表現且經過40℃熱處理後會增量，表示dkey mRNA表現量的變化與microarray的結果吻合。為了進一步證實dkey在huORFchop擔任轉譯抑制的角色，首先在in vivo斑馬魚胚胎中注射huORFchop-luciferase及dkey DNA，發現luciferase activity會上升，表示dkey會壓制huORFchop的轉譯抑制能力。接著，為了證實chop mRNA轉譯會受dkey的影響，利用西方浸漬法得知dkey造成huORFchop轉譯抑制能力的喪失是透過eIF2α磷酸化的上升而使CHOP蛋白質的表現量增加。進一步在in vitro中同樣進行luciferase assay及西方浸漬法也得到相同的結果。接著在in vitro中證實非磷酸化eIF2α(eIF2α /S51A) 會造成dkey降低對於huORFchop轉譯抑制喪失的能力；反之持續磷酸化的eIF2α(eIF2α /S51D) 則會促進dkey對於huORFchop轉譯抑制喪失的能力，確定dkey對於huORFchop轉譯抑制喪失的能力受到eIF2α磷酸化狀態所影響。我們也透過免疫共沉澱法(Co-immunoprecipitation) 得知dkey能與eIF2α蛋白質結合。為了確定dkey對於huORFchop轉譯抑制的喪失是透過其endoribonucleases的能力，我們同時轉染dkey DNA及huORFchop-GFP DNA到HEK293T細胞株，藉由北方浸漬法的方式並且以GFP-probe偵測會造成huORFchop-GFP RNA進行RNA的切割。綜合上述實驗結果，本研究發現磷酸化eIF2α造成dkey對於huORFchop喪失轉譯抑制的能力使得CHOP蛋白質的表現量增加，另外也證實DKEY蛋白質能與eIF2α蛋白質結合。所以，我們認為dkey可能透過與eIF2α的結合而找到huORFchop的位置，然後以endoribonucleases的能力，破壞huORFchop的結構促使其轉譯抑制的喪失，而造成CHOP蛋白質的表現。

• 學位論文

新型海洋生物色澤蛋白之基因、結構與產生不同成色的突變和機制

GFP-like protein family在生物學應用上為良好的marker以及reporter，傳統螢光蛋白常需利用螢光設備幫助觀察因而具有限制性，且色彩主要侷限於紅、黃、綠等顏色。為了拓展可應用的色彩，以及提高觀察的便利性，我們希望獲取新種的藍色或紫色色澤蛋白。我們從表現天然藍、紫色色彩的地毯海葵觸手組織中選殖出新種的紫色色澤蛋白shCP與新種的藍色色澤蛋白sgBP。純化後的shCP於574 nm處有最大的吸收峰值，sgBP於608 nm處有最大的吸收峰值。藉由結構導向的定點突變法改變色澤蛋白chromophore以及chromophore周圍5 Å的氨基酸殘基，發現對於shCP chromophore的第63位置的氨基酸glutamate突變為serine(E63S)時，可使原來的紫色蛋白呈現粉紅色；而蛋白質序列具Q39S突變時，則為紅色；另一方面，位於sgBP chromophore周邊第157位置的serine突變為S157C時，可將突變蛋白變為深藍色色澤。為了證明shCP與sgBP做為生物性標記(biomarker)的實用性，我們構築好以斑馬魚α-actin啟動子表現shCP、sgBP與及其突變型色澤蛋白的表現載體並以顯微注射法進行基因轉殖。經轉殖後的胚胎在飼育至性成熟後可篩選出具有transient色澤表現的成魚，例如帶有shCP表現載體的斑馬魚其肌肉中會出現紫紅色；帶有shCP-E63S的斑馬魚可呈現粉紅色；帶有sgBP的斑馬魚則可表現藍色，且由配對實驗可確認色澤基因可被穩定遺傳至子代。本研究應用新種色澤蛋白並找出可利用突變造成chromophore deprotonation的效果進而影響蛋白顏色表現的機制，並且確認色澤蛋白與其突變衍生物做為生物性標記的應用性。

• 學位論文

探討酵母菌Ndt80蛋白對減數分裂期DNA複製的可能調控功能

在減數分裂中，一次DNA複製之後連續進行二次細胞核分裂。然而，在二次分裂期之間如何控制DNA不再進行複製目前並不是很清楚。在出芽酵母菌中，Ndt80是一個在減數分裂特定表現蛋白，它是啟動染色體分離以及孢子形成的一個必要轉錄因子。我們發現，若在營養生長細胞中異位表現Ndt80，則細胞出芽會受到抑制而且無法進行DNA複製，這顯示在減數分裂中Ndt80也可能具有抑制DNA複製的能力。我們認為Ndt80可能參與減數分裂二次分裂期間不再發生一次DNA複製的調控。 為了證明Ndt80是否在減數分裂中具有抑制DNA複製的能力，我們使細胞在減數分裂DNA複製期(pre-meiotic DNA replication)之前提早表現NDT80。在起始減數分裂時利用IME1啟動子將NDT80提早表現，細胞仍然可以進行DNA複製，但大多數的細胞會停滯在第一次減數分裂期。若將NDT80提早表現在減數分裂前的培養(pre-meiotic incubation)時，此時大部分細胞處於後複製複合體期(post-RC state)，則部分細胞的DNA複製受到抑制。然而，若將NDT80表現在G1時期的細胞，則看不到DNA複製被抑制的現象。由這些結果可以得知，Ndt80在減數分裂中也許能透過防止前複製複合體(pre-RC)形成而抑制DNA複製，但是當pre-RC存在時卻無法抑制DNA複製。

• 學位論文

以動態磷酸化蛋白體學探討丹參酮IIA作用於胃癌AGS細胞的反應路徑

胃癌是常見的致死癌症之一，然而到現在仍然沒有一個有效的治療方法或是藥物可以對付胃癌，所以尋找一個安全且可以治療胃癌的方法或藥物是我們的首要目標。在先前的研究中，丹參酮IIA來自於天然的中草藥＜丹參＞萃取物，具有抗癌的功能，在許多不同的癌症中它都具有相當好的功效，因此丹參酮IIA是相當具有潛力的藥物。然而目前的研究對於丹參酮IIA抗癌的整體反應途徑仍尚未清楚。在本篇研究中我們利用動態磷酸化蛋白體技術揭露丹參酮IIA在胃癌AGS細胞中的調控及訊息傳遞路徑。在本次實驗中我們偵測到3,332個磷酸胜肽，辨認出1,092個磷酸蛋白質，具有3,615個鄰酸化位置，表現量有差異的磷酸位置和磷酸蛋白分別為349個和220個，我們進而利用生物資訊學分析這些表現量有顯著差異的磷酸化蛋白質。結果顯示丹參酮IIA在短期會影響胃癌細胞的訊息核糖核酸的處理、引發去氧核醣核酸的受損和蛋白質未折疊或折疊錯誤。此外，去氧核醣核酸的受損及蛋白質未折疊或折疊錯誤發生在丹參酮IIA長時間處理的細胞中。這些結果顯示丹參酮IIA的反應傳遞途徑可能是跟這兩者有關。最後，我們利用西方墨點法證實丹參酮IIA影響蛋白質折疊。本篇研究利用動態磷酸化蛋白體技術去探討丹參酮IIA在胃癌細胞的抑制效果，希望本篇研究可以對胃癌的治療方向或是策略帶來新的曙光。

• 學位論文

探討MTHFD2在神經母細胞瘤發展進程扮演的角色

神經母細胞瘤 (Neuroblastoma) 是胚胎在發育的過程中交感神經脊分化失敗形成惡性腫瘤的一種兒童癌症，臨床研究發現轉錄因子MYCN基因擴增的現象和神經母細胞瘤的不良預後及惡化程度具有關聯性，但目前對於MYCN如何去調控腫瘤的進程機制仍然尚未明瞭。在本篇研究中我們先從基因表達綜合數據庫 (Gene expression Omnibus, GEO) 分別將高風險 (年齡大於18個月，第四期) 的神經母細胞瘤病人分成MYCN多倍數與非多倍數去做微陣列基因顯著性分析驗證 (significance analysis of microarrays, SAM)，發現在MYCN多倍數的神經母細胞瘤病人中其亞甲基四氫葉酸脫氫酶2 (MTHFD2) 也會顯著地被表現，兩者間具有高度正相關 (P < 0.001)。此外在我們染色質免疫沉澱–測序（ChIP-Seq）的結果中也發現，MYCN會在亞甲基四氫葉酸脫氫酶2的轉錄起始點附近區域有很強的結合 (P = 3.7e-18)。MTHFD2在胚胎發育時期扮演單碳代謝途徑的重要酵素，目前研究指出MTHFD2的表現和乳癌的低存活率有關，在我們神經母細胞瘤病人的存活率分析中也看到了一樣的情形 (P < 2.4e-13)，由上述的資料分析，我們推測MYCN會調控MTHFD2的表現而影響神經母細胞瘤的進程。為了確定他們之間的相關性，我們分別在神經母細胞瘤細胞株中抑制或增加MYCN的表現量，發現MTHFD2的表現量也會與之有相同趨勢的改變。更進一步，啟動子冷光偵測結果顯示MTHFD2是一個受MYCN直接轉錄調控的基因。接著我們於MYCN高表現的SK-N-DZ細胞株中利用小髮夾核醣核酸 (shRNA) 抑制MTHFD2，亦或是在MYCN低表現的SK-N-AS細胞株中大量表現MTHFD2，由結果發現MTHFD2會促使神經母細胞瘤細胞株的生長。這項研究結果指出MTHFD2在神經母細胞瘤的進程中或許扮演重要的角色，也許是未來治療神經母細胞瘤的一項潛力。

• 學位論文

整合染色體免疫沉澱定序與基因表現分析揭露PAICS在神經母細胞瘤中為MYCN重要的下游調控基因

神經母細胞瘤 (Neuroblastoma : 簡稱NBL或NB) 是一種兒童癌症，其源發於胚胎神經脊當中的交感神經系統，臨床期數越高則越難被治癒。在臨床特徵中MYCN致癌基因異常放大是評估神經母細胞瘤不良預後的重要指標，且MYCN在腫瘤學中也被強調其會透過大量轉錄調控使細胞不正常增生。為了探究MYCN所調控的基因在神經母細胞瘤的進程中扮演的重要性，我們首先在大量表現MYCN的SK-N-BE (2) –C細胞株中，利用染色質免疫沉澱定序 (ChIP-Seq) 分析MYCN結合的啟動子區域，再從基因表達綜合數據庫 (Gene Expression Omnibus, GEO)中整合神經母細胞瘤患者的基因數據，並找到那些會和MYCN大量表現有高度相關的基因。結合ChIP-Seq和GEO分析結果，我們選擇了PAICS為候選基因來做更進一步的實驗。我們使用了tet-21n會受四環黴素調控MYCN (tet-off)表現的細胞株，並利用即時聚合酶鏈式反應 (Real-time PCR)偵測，發現PAICS（磷酸氨基咪唑羧化酶、磷酸氨基咪唑琥珀酰甲酰胺合成酶）與嘌呤生合成相關的代謝酶，其在MYCN被抑制時會顯著下降，以及在不同MYCN表現量的組織和細胞也觀察到MYCN與PAICS有正向表現相關，這表示MYCN可能會直接活化PAICS此下游基因，進一步使用啟動子冷光分析也發現PAICS具有受MYCN調節的啟動子存在。降低PAICS基因的表現量亦顯示抑制細胞生長的效果。我們的結果表明，在惡化的神經母細胞瘤中PAICS可能為腫瘤發生和癌症生物學研究裡一個具有潛力的治療靶標。

• 學位論文

BLMP-1經由醣基轉移酵素BUS-8調控線蟲上層表皮細胞的形狀

表皮系統(epidermis systems)位於生物體的最外層，表皮細胞之間存在細胞連結(cell-cell junctions)分子，將表皮細胞緊密的排列再一起，可作為生物體與外界環境的保護屏障，以避免受到外來物質的入侵。線蟲的表皮接縫細胞(seam cells) 直線排列在身體的左右兩側，每側各有16顆接縫細胞，並且鑲嵌於圓柱形的hyp7合胞體(syncytium)細胞間，由黏著連接分子(adhesion molecules)將接縫細胞與hyp7皮下細胞連接在一起。在第四幼蟲時期，線蟲的16個接縫細胞會融合成一個多核的合胞體(syncytium)，我們利用AJM-1::GFP或HMR::GFP的螢光融合蛋白來標記連接分子，可以觀察到在成蟲的細胞邊界會形成平行排列的兩條線，但在blmp-1基因缺失的成蟲中，會觀察到類似於泡泡狀的異常細胞型態。利用分布在表皮底層的分子蛋白，發現泡泡狀的異常現象只存在於表皮細胞的上層區域，而細胞底區域是正常的。經不同時間的螢光顯微照相追蹤發現 ，blmp-1突變株在幼蟲蛻皮剛進入成蟲階段，接縫細胞邊界變得不規則，兩條邊界的距離縮短，並且會產生交接點。因此blmp-1基因在維持成蟲表皮細胞型態扮演重要的角色，在hyp7或接縫細胞降低blmp-1活性皆可造成泡泡狀的接縫細胞形態，顯示blmp-1在hyp7與接縫細胞中都不可或缺的。blmp-1是一個轉錄抑制因子(transcription repressor)，相似於哺乳類中的PRDI-BFI/blimp-1(B lymphocyte-induced maturation protein 1)，因此我們篩選出含有BLMP-1 binding domain且在blmp-1缺失的線蟲中其表現量較高的基因，利用RNAi knockdown的方式，試圖找出降低這些候選基因的表現可以下降成蟲異常表皮細胞型的比例的產生，並發現在blmp-1突變的線蟲中抑制bus-8的表現，可以大幅度的降低異常表皮細胞的型態。BUS-8是一個參與醣化作用的蛋白，且表現在接縫細胞內。另外，發現其他醣化作用的蛋白bus-2,bus-4和bus-12也可以下降部分異常表皮細胞型態。因此我們認為blmp-1會透過bus-8或其他醣化作用蛋白，來維持成蟲表皮細胞的型態。