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藉由定量磷酸化蛋白質體學分析探討MCM2在肺癌細胞中的調控網絡

微小染色體維持蛋白2（MCM2）是DNA複製的主要調控因子。 MCM2與其它MCM蛋白結合形成六聚體複合物（MCM2-7），並發揮具有解旋酶活性的功能。其功能除了用於DNA解旋，還會限制DNA在每個細胞週期僅複製一次。 MCM2在增殖細胞中表現量高，因此在許多種癌症被廣泛用作生物標誌物。然而，MCM2的分子調控機制在肺癌細胞中研究甚少。在這項研究中，我們用A549 (wild-type p53）和H1299（p53-null）細胞株探討MCM2在肺腺癌扮演的角色。研究結果顯示，在A549細胞中過表達MCM2會促進細胞增殖,而在H1299細胞中抑制MCM2表達則會減少細胞增殖。接著，我們進行定量磷酸化蛋白質體學來揭示在肺癌細胞中受MCM2調控的重要下游基因的網絡。我們在過度表達MCM2的A549細胞中共鑑定出594個磷酸化蛋白及1494個磷酸化位點。這些磷酸化位點中，有164磷酸化蛋白具有顯著差異。此外，在低表達MCM2的H1299細胞中，我們鑑定588個磷酸化蛋白及1599個磷酸化位點。這些磷酸化位點中，有82個磷酸化蛋白有顯著差異。這些有顯著差異的磷酸化蛋白參與了RNA剪接，細胞週期和細胞骨架等功能。在表達MCM2的A549細胞過和低表達MCM2的H1299細胞中，我們發現一個共同被調控的磷酸化位點，即是絲氨酸-99（Ser99），它位在高遷移率族蛋白HMG-Ⅰ/ HMG -Y（HMGA1）上。這表明HMGA1-Ser99對肺癌細胞有著重要的調節作用。我們的結果提供肺癌細胞受MCM2調控的磷酸化蛋白質體，並發現其調控磷酸化網絡。這些研究為肺癌治療提供了新的目標。

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飼料中添加樟芝培養基對青魚的成長與免疫之影響

本篇研究將樟芝菌絲體培養基與使用80 %乙醇萃取的樟芝菌絲體培養基兩種方式分別以不同劑量添加到飼料中，探討其對青魚成長、非特異性免疫效果以及血液指標的影響。 實驗在飼料中直接添加組分別添加樟芝培養基0.5 %、0.75 %、1.25 %、2.5 %和萃取添加組分別添加樟芝培養基0.5 %、0.75 %、1.25 %。使用平均體重約13.03±1.81 g 的青魚，每組10尾雙重複，飼養42天。每兩週稱重一次，并檢測非特異性免疫及血液生化指標，包括巨噬細胞超氧陰離子（O2-）產生率、巨噬細胞吞噬作用（Phagocytic activity）、溶菌酶活性（Lysozyme activity）和鹼性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）、三酸甘油酯（Triglycerol）及總膽固醇（Total cholesterol）的含量等。 結果發現，餵食添加樟芝培養基的飼料對魚體的生長有促進作用，其中直接添加樟芝培養基1.25 %（AC1.25）組別的成長狀況最好。實驗組相較于對照組在溶菌酶活性上均有提升的現象。超氧陰離子的檢測中實驗組也高於對照組的表現。同時實驗組在吞噬細胞的吞噬作用中也整體上高於對照組的結果。在ALP的含量上隨著餵食天數的增加，實驗組整體上高於對照組，而TG和T-Cho方面，前期實驗組整體上低於對照組，後期相近或高於對照組的結果。經多重比較分析，直接添加組選擇1.25 %（AC1.25），而萃取添加組選擇0.75 %（ACE0.75）在成長表現與非特異性免疫方面具有最好的效果。

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硝酸鹽轉運蛋白CHL1與氫離子幫浦AHA2的交互作用

CHL1是一個協同運輸的硝酸鹽轉運蛋白，它透過氫離子驅動力的協助來運輸硝酸鹽。此外，CHL1還是一個雙親和性蛋白，會依據環境中硝酸鹽濃度而改變其對硝酸鹽的親和性。本實驗室先前酵母菌雙雜合篩選中，發現CHL1會與氫離子幫浦AHA2互相結合。已知AHA2是一個能創造氫離子驅動力的自我抑制型幫浦蛋白，需要其它激酶或去磷酸酶對AHA2蛋白質C端R domain進行磷酸化或去磷酸化修飾，才可以調控其氫離子幫浦活性。本研究針對CHL1在運輸硝酸鹽上對氫離子的需求，以及CHL1與AHA2的結合進行分析。爪蟾卵硝酸鹽吸收實驗結果顯示，在植物生理pH值範圍內，CHL1在高親和性模式下，硝酸鹽吸收能力隨pH值下降而上升；在低親和性模式下，吸收能力幾乎不受pH值影響。以酵母菌雙雜合實驗分析CHL1與AHA2的結合，發現不同親和性模式下的CHL1與AHA2的結合強度沒有差異。而CHL1除了能與AHA2結合之外，還可以與同一家族的AHA1、4、11互相結合。分析CHL1與AHA2的不同片段區域之結合強度，發現CHL1與AHA2的R domain結合能力非常微弱，而對AHA2之第七到第十個穿膜蛋白的結合能力最強，但若第七到第十個穿膜蛋白，加上最末端R domain，則結合能力會下降，推測R domain會阻礙CHL1與AHA2的結合。我們亦使用電腦模擬CHL1與AHA2可能的結合方式，並與酵母菌雙雜合試驗結果進行比較，推論出最有可能之結果。此外，也發現能調控CHL1親和性轉換的CIPK23與ANI皆會與AHA2結合，且這樣的結合需要R domain的存在，推測它們能夠調控AHA2的活性。但是，我們以RS-72互補實驗發現，CHL1、CIPK23皆無法獨自活化AHA2的氫離子幫浦活性。我們推測，CHL1可能需要與CIPK23或其他蛋白共同合作，才有辦法對AHA2進行調控。

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SNAP-25b的磷酸化調控分泌細胞的胞吐作用動態及發育中大鼠的視網膜波

SNARE複合體可調控囊泡融合。在三個SNARE蛋白質中，僅SNAP-25（SN25）可被蛋白質激酶A（protein kinase A，PKA）和蛋白質激酶C（protein kinase C，PKC）磷酸化，且磷酸化位置分別在SN25的T138和S187。以往的研究顯示，PKA或PKC磷酸化的SN25可藉由控制囊泡池（vesicle pool）的大小或補充囊泡池來調控囊泡的分泌量。然而，目前仍不清楚（1）SN25的磷酸化如何調控胞吐作用的動態;（2）此調控是否可以顯著影響大規模的網路活動。為了解決第一個問題，我們利用可測得單一囊泡釋放的氧化電流技術（single-event amperometry），在PC12細胞內研究SN25b的磷酸化對胞吐動態的影響，尤其是對融合孔（fusion pore）動態的影響。此研究中，我們使用兩種不同secretogogues在短時間內(約1分鐘)誘發鈣離子依賴性胞吐作用（Ca2+-dependent exocytosis），包括高濃度氯化鉀（KCl）、高濃度氯化鉀與福斯克林（Forskolin，一種腺苷酸環化酶的激活劑；FSK）的混合液（KCl FSK）。與對照組相比，KCl降低過量表現SN25b細胞的囊泡釋放速率，但KCl FSK更為顯著降低過量表現SN25b細胞的囊泡釋放速率，藉由免疫沉澱實驗顯示KCl FSK可使SN25b被PKA磷酸化，降低鈣離子依賴性胞吐作用的速率。此外， 和SN25b相比，過量表現SN25b突變株（SN25b-T138A或SN25b-S187A）的細胞，其囊泡釋放速率增加，顯示經由被PKA或PKC磷酸化的SN25b會負向調控囊泡釋放速率。有趣的是，在過量表現SN25b-T138A的細胞中，KCl FSK會減少其融合孔開啟的時間，顯示被PKA磷酸化的SN25b可穩定融合孔，但SN25b-S187A則否；因此，SN25b可在短時間內藉由PKA的磷酸化來調控胞吐作用的動態，此現象可能與提高SN25b與Stx1的交互作用有關。為了探討SN25b的磷酸化是否能進一步影響大規模的網路活動，我們檢測發育中大鼠視網膜內的模式化、自發性放電的現象（稱為視網膜波，此現象伴隨著週期性PKA和PKC活性的上升）。我們在突觸前神經元（星狀無軸突細胞，starburst amacrine cells，SACs）中過量表現SN25b或其突變株，利用即時鈣離子影像偵測在視網膜節神經元(retinal ganglion cells) 內鈣離子濃度瞬間的變化。在SACs過量表現SN25b，會降低視網膜波的頻率；而SACs過量表現SN25b-T138A或SN25b-S187A ，不會改變視網膜波的頻率。這些結果顯示被PKA或PKC磷酸化的SN25b可負向調控突觸前神經元神經傳導物質的釋放，進而可影響突觸後神經元的大規模網路活動。總而言之，我們的研究結果證明， SN25的單一氨基酸上的轉譯後修飾（post-translational modification），可調控神經傳導物質釋放的動態以及突觸後神經元大規模的網路活動；故細胞內訊息傳遞分子的即時變化，足以在短時間內造成神經傳導的多樣性。