國立臺灣大學生化科學研究所學位論文/Institute of Biochemical Sciences
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
- 學位論文
RNF4是個分布在細胞核中，具有RING finger的蛋白質，目前已知可以與許多不同細胞核中的蛋白質作用，此外，能夠調控以類固醇受器為主的以及一些細胞中基礎的轉錄機制。另外，RNF4也被發現可以作為協同的抑制因子或是活化因子來影響轉錄機制的進行。在這次的研究中，我們發現了RNF4可以促進AP-1的轉錄活性。而且，藉由Luciferase assay的實驗中，我們發現在RNF4促進AP-1的轉錄活性過程中，c-Jun amino-terminal kinase (JNK) 以及extracellular signal-regulated kinases (ERK)這兩類的蛋白質都參與其中。除此之外，進一步的利用免疫沉澱的方式，我們也證明了RNF4能夠與活化狀態的磷酸化JNK及磷酸化的ERK有直接的作用。在截短的RNF4實驗中，我們也發現了RNF4失去了C端的RING finger區域對於RNF4促進AP-1的轉錄活性就會消失。而在RNF4上胺基酸序列第127的Threonine和第166的Serine這兩個磷酸化的位置，如果被突變成Alanine之後也會失去部分活化AP-1的能力。
- 學位論文
肌無力症是一種自體免疫疾病，主要的致病原因是由於病人體內產生一種乙醯膽鹼受體（acetylcholine receptor）的抗體，因而阻礙神經的傳導，並造成乙醯膽鹼受體的減少。本論文主旨在分析肌無力病人的T細胞接受器?鴗WVδ5及V?的基因使用，以及這些T細胞接受器CDR3 區域的核酸序列，希望藉由這些實驗能分析出與肌無力症相關的致病的T細胞，以期望可以藉由知道這些T細胞接受器的基因序列發展出專一的治療方式，而能更有效的治療肌無力症。 本論文中，我們取得四位肌無力病人（MG-D, MG-Y, MG-Ⅳ, MG-L）和三位正常人（HC-W, HC-R, HC-A）的周邊血液，及MG-L的胸腺內T淋巴細胞及甲狀腺的組織侵入性淋巴球(tissue infiltrating lymphocyte)來作分析，利用RT-PCR的技術，分析Vδ5-Cㄓ垝?-Cㄢo兩種基因組合在肌無力病人和正常人的表現情形，並進一步做T細胞接受器上CDR3區域的DNA定序分析。 首先，我們觀察到在Vδ5-Cㄟ穧]的使用上，肌無力病人的T細胞接受器CDR3區域的第六個或第七個（junction區域）帶有Arginine（R）正電荷氨基酸的比例比正常人高出很多，這樣的結果和EAMG老鼠所得到的結果有原先未料到的高符合性，因此，我們推斷此類的T細胞應該就是所謂的致病的T細胞。 在V?-Cㄟ穧]的使用上，除了MG-Ⅳ以外，其餘肌無力病人和正常人間T細胞接受器CDR3區域的氨基酸分子並沒有什麼差別，但在V?-Cㄟ穧]的使用上，我們找到了新的，可說是人類第三條的invariant TCR，也就是V?-J?2-Cㄢo條T細胞接受器?魽A而這類T細胞接受器顯然被病人的CD4+CD8+DP T cell所使用，且有expansion的現象。 我們相信目前所得到的結果，已帶領我們走向正確的了解致病的TCR，下一步將走向老鼠的實驗系統，製造出帶有此類TCR的transgenic mice，以確定此些TCR對導致肌無力所扮演的角色，並進而發展出對此類自體免疫疾病的專一療法。
- 學位論文
在植物的種子中含有大量的phytate (myo-inositol hexaphosphate，IP6) 來負責儲存磷酸 (Pi)，以利未來在發芽時所用。Phytase的作用為將phytate水解產生磷酸根及inositol polyphosphate衍生物。在畜牧業上的應用方面，也會將phytate及phytase作為飼料中的添加劑，以做為家禽或豬隻的磷酸來源。 一般而言，phytase可分為Histidine acid phytase family及Alkaline phytase family兩種。而我們所要討論的Selenomous ruminantium phytase的作用機制並不屬於之前所了解的Histidine acid phytase family或Alkaline phytase family。藉由結構比對我們發現到其活性位置的結構高度相似於dual specificity phosphatase family。並且也發現到相較於其他物種的phytase，S. ruminantium phytase有著較高的催化能力。所以我們希望經由S. ruminantium phytase的研究來增加在商業上的應用價值。 我們試著藉由點突變的方法，將主要負責催化的P-loop上Cys241改為Ser241、Ala241及有輔助弁鄋斡PD-loop上Asp212與Pro216分別改為Ala212與Gly216，來測量其在不同溫度下活性的改變，試著了解這些loop上這一些高度保留的胺基酸對催化活性的影響。發現到P216G的活性會隨著溫度的升高而下降。C241A、C241S、D212A則都會失去活性，這意味著這些位置跟催化弁鄏陬蛪奶j的關係。同時利用CD spectra，試圖由Tm值來檢視活性的改變是否是因為由於溫度的升高而使構型改變所造成。最後將C241A以E. coli大量表現，並以sodinm malonate為主沉澱劑來結晶，以X-ray的方式來了解phytase在結構上的特性及其與substrate的相互作用。由結構上卻意外的發現作為主沉澱劑的malonate會結合於活性位置。這個結構可以幫助我們了解polycarboxyl acid如何對phytase active site產生競爭抑制作用。
- 學位論文
比較人工合成乙醯雌酚 (DES, diethylstilbesterol) 誘導幼鼠所產生之子宮液與正常成鼠於動情週期所產生之子宮液兩者蛋白質的成分，發現一個分子量為 14kDa 、等電點為 4.6 的蛋白於成鼠表現，但於 DES 誘導的幼鼠沒有表現。由 MALDI-TOF-TOF 質譜分析，證實此一蛋白質為 proline-rich acidic protein (PRAP) 。 於成鼠的動情週期中， PRAP mRNA 表現於動情期 (estrus) 和早期動情後期 (metestrus I) ，但於動情前期 (proestrus) 表現較少，於後期動情後期 (metestrus II) 和動情間期 (diestrus) 則快速遞減。 在未成熟的老鼠子宮並不會表現 PRAP mRNA 。利用免疫組織化學法檢視 PRAP 在子宮主要分布於子宮內膜的上皮細胞和腺體表皮細胞。 對未成熟的小鼠施予動情素 (17β-estradiol) 或動情素加上黃體素 (progesterone) 三天後，於子宮中檢視到發現少量 PRAP mRNA ，也於子宮液檢測到少量 PRAP 。但於六天後，施打動情素加上黃體素的動物會產生大量 PRAP mRNA 。 DES 和動情素雖然都能加速幼鼠子宮達到成熟並分泌子宮液，但表現 PRAP mRNA 的時間點卻不相同。 將新生之幼鼠或三週大幼鼠施以 DES ，待其成熟於動情期 (estrus) ， 前類動物子宮之 PRAP mRNA 的表現與正常成鼠無明顯差異，後類動物子宮之 PRAP mRNA 和子宮液之 PRAP 蛋白於正常成鼠則有顯著的減少。
- 學位論文
摘 要 Glycals是帶有不飽和官能基之糖分子，依照其雙鍵的位置可分為環外雙鍵：稱為exo-glycals，與環內雙鍵：稱為endo-glycals。就醣類化學的研究而言，edno-glycals已被開發出多種的反應用來合成包括了路易斯和血型抗原、神經節醣、與腫瘤抗原有關的醣共軛分子。所以結構上類似的exo-glycals應具有相當的應用性，但迄今甚少有文獻提及。本實驗室先前曾製備延伸基團為羥基或醋酸根之exo-glycals，以外加的醇類化合物作為親核劑，進行高度立體選擇性的醣加成反應，成它a合成雙醣、醣胜肽與醣脂質之類的醣類分子衍生物，並且有相當不錯的產率，初步証實exo-glycals的反應性並不亞於endo-glycals。因產物皆有雙鍵位移的現象，所以這個加成反應屬於費里爾 (Ferrier) 型式的重排。 本論文的研究主題在於探討exo-glycals以不同的條件進行費里爾重排反應所造成的影響，以擴大在合成化學上的應用性，並進而製備具有生理義意醣類分子。我們將特別深入研究分子間與分子內的醣加成反應。 在分子間醣加成反應部份，本論文合成延伸基團為第三丁氧羰基 (t-Boc) 之exo-glycal，以外加的醇類化合物作為親核劑，進行重排反應。在此，對於影響反應性的四個因素加以探討，包括：溫度、溶劑、路易士酸與親核劑。我們首先要探討以不加入路易士酸加熱方式能否驅動重排反應，再與路易士酸存在下加熱方式相比較，觀測反應效益是否有所提升。接著選取不同種類的溶劑進行實驗，嘗試找出可將重排反應的效能發揮至最大的溶劑。再來以IIA族、IIIA族、IVA族、過渡金屬與後過渡金屬元素之路易士酸催化反應，觀察重排反應是否可用不同類型的路易士酸催化反應，並尋找出較適合重排反應之路易士酸。最後，將多種親核劑(如：單醣分子、胺基酸、立障大之醇類分子) 以較適合之溶劑與路易士酸進行重排反應，並將數據與之前本實驗室的成果比較之。 於分子內重排方面，我們將exo-glycals的延伸基團連接不同的醇類分子，包括：正丁醇、正戊醇、苯甲醇、甲氧乙醇、單醣分子。以加熱反應與路易士酸 (BF3.OEt2、TMSOTf)催化二種方式比較其加成的反應性，探討分子內醣加成反應的可行性，並且將所得之結果與上述分子間醣加成反應的對照之。 由分子間醣加成反應的實驗資料顯示，硝基烷類與二氯甲烷皆為加成反應的最佳溶劑。在路易士酸方面，加成反應對路易士酸並無太高的偏好。A族、過渡金屬與後過金屬元素之路易士酸大都可驅動重排反應，並且有相當不錯的產率。以多種親核劑與exo-glycals反應亦大都有不錯的反應性。在分子內醣加成的部份，熱裂解與路易士酸均尚未找到最佳的條件，而無法得到令人滿意產率。
- 學位論文
中文摘要 BC1是一個74KD的蛋白質，最初被發現在腦中，同時也在16個細胞株中被發現。先前的研究指出BC1能夠免除Huntingtin所誘導的聚集效應(aggregation)，同時也可以降低細胞毒性。 許多癌症的研究發現染色體20q13的位置大量增生會造成許多癌症的發生，例如：卵巢癌、乳癌、大腸癌、及胰臟癌。BC1正好座落在染色體20q13的位置。因此，我們想瞭解 (1) BC1是否具有致癌的特性？ (2) 是否抑制BC1可以降低腫瘤的形成？ 首先，我們先建立能夠大量表現BC1的細胞株 (stable cell line)，我們發現在細胞實驗過程中，BC1會促進細胞增生及誘導細胞轉型。同時，在活體老鼠實驗中，BC1會導致腫瘤的生長。 其次，我們利用BC1的反意質體(antisense plasmid)來降低細胞株中BC1的表現量。結果發現，降低BC1的表現量可以有效抑制人類乳癌細胞的增生。 綜而言之，這些結果證實BC1與致癌能力及細胞存活能力有關，同時也證實BC1具有發展抗癌藥物的潛能。
- 學位論文
一種新型的冠狀病毒(SARS-CoV)是造成嚴重急性呼吸道症候群 爆發的原因。這個冠狀病毒利用SARS 3C-like proteinase 做大範圍的 酵素分解反應來產生複製和轉譯所需要的酵素。因為這個原因SARS 3C-like proteinase 就成為藥物設計的主要目標。把在SARS 3C-like proteinase 中，參與催化作用的一個殘基，位於第145 的半氨胱酸 cysteine)，突變成丙胺酸(Alanine)。這個突變的酵素依序被大量表 現、純化和結晶。得到一個單斜晶系、空間群為C2 和解析度2.5 Å 的晶體。每個不對稱單元(asymmetric unit)含有一個二聚體。由結構知 道活性區域被屬於另一個不稱單元的單體所鑲嵌。這個研究提供一些 資訊來了解基質和酵素結合，能夠幫助針對嚴重呼吸道症候群或是其 他相關冠狀病毒的藥物設計。
- 學位論文
中文摘要 人類胎盤特殊轉錄因子hGCMa屬於GCM轉錄因子基因家族，可控制融合蛋白syncytin基因表現，促使胎盤絨毛表面的細胞滋養層細胞(cytotrophoblast)融合為融合細胞滋養(syncytiotrophoblast)，此對胎盤特化絨毛構造的形成十分重要，同時也是維持胚胎發育的必要過程。對於hGCMa的生理弁鄐w有釵h文獻進行探討，然而此轉錄因子活性的調控機制卻仍然未明。 本實驗計畫，證明hGCMa蛋白在細胞中可受長鏈polyubiquitin chain標定，並由26S proteasome進行降解，同時，和F-box protein p50存有專一性的交互作用，而F-box protein即是SCF complex這種E3中，負責識別受質的蛋白分子。進一步的研究指出，hGCMa藉由蛋白質N端的GCM motif和p50結合，且需在此轉錄因子被磷酸化後，p50才能與其產生交互作用。另外，我們也發現帶有F-box protein p50的SCFp50，可減低細胞中hGCMa蛋白的含量；而除去F-box motif的p50或F-box protein p46則無此能力。然而，除去F-box motif的p50已無法引導蛋白降解，但將其和hGCMa共同轉染，可發現此種具有缺陷的p50蛋白和野生型p50蛋白，均具有抑制hGCMa轉錄活性的能力。 上述證據顯示，轉錄因子hGCMa在細胞中受ubiquitin-proteasome蛋白降解路徑的控制，且此蛋白應是迄今第一種被鑑定出來由SCFp50這種E3引導的受質。而F-box protein p50除了引導hGCMa進行降解之外，本身也可能是此轉錄因子的協同抑制因子(co-repressor)。總括而言，本篇報告有助於釐清hGCMa的降解機制，並可協助瞭解此轉錄因子在生物體內的活性調控方式。
- 學位論文
膜融合是釵h生物反應的重要步驟之一。對具有外套膜的病毒而言，寄主的細胞膜與病毒的外套膜之間的融合，是這類病毒感染寄主的第一步。凝血素（Hemagglutinin）是流行性感冒病毒外套表面的醣蛋白，它可使病毒的外套膜和細胞內含體（endosome）的膜融合，內含體中的微酸性環境使得凝血素的結構轉為可產生膜融合的狀態，使病毒的內含遺傳物質得以進入細胞質內。 凝血素的結構可分為兩個弁鈰炩禲GHA1和HA2。HA2的前20個胺基酸序列稱為融合胜肽，其結構主要由第2到第11個序列所形成的
- 學位論文
小鼠儲精囊液蛋白SVS I 與雙胺類氧化酶(DAO)在一級結構上具有56%的相似度，且兩者的基因Svs I與Abp1皆位於小鼠染色體相鄰的位置上。進一步基因組序列分析顯示小鼠染色體6B2.3區段內，Abp1-like genes具有分化叢集的現象。大鼠染色體4q23-4q24區段內的的Abp1-like genes也有相同的現象，但人類相對應的染色體7q36區段內僅有Abp1 的存在。演化樹的分析中顯示，Abp1-like genes是由共同的祖先所分化出來的。 小鼠的Abp1-like genes共含有四個完整的基因：Abp1、Svs I、Loc243375和Loc243376。其中Abp1主要表現在小鼠的子宮，而Svs I、Loc243375和Loc243376主要表現在雄性生殖道中。Abp1在子宮中的表現受到了動情素的調控。在儲精囊中，Svs I的表現量則超過Loc243375和Loc243376的一千倍。 進一步的研究而知DAO表現於小鼠子宮的腔內上皮細胞及腺體上皮細胞內。子宮液中的DAO以雙硫鍵的方式結合形成homodimer。在子宮正常週期中，動情期有最多的DAO表現，同時也具有最高量的DAO酵素活性。 SVS I蛋白大量表現於儲精囊，但儲精囊液卻不具有DAO酵素活性。顯示演化後的SVS I已失去DAO酵素活性。SVS I以雙硫鍵與儲精囊液中其他結構性蛋白結合，形成高分子量聚合物。此雙硫鍵的鍵結可增加SVS I 做為轉麩醯胺酶受質的能力。本論文證明了雙胺類氧化酶基因家族在小鼠中的分化產生了不同弁鄋滌穧]以符合生理上的需求。