國立臺灣大學生化科學研究所學位論文/Institute of Biochemical Sciences
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利用鍍鋁的玻片表面，我們研發出新型的醣晶片平台。在早年的研究中，磷酸分子被證實能夠快速與氧化鋁進行結合反應。利用這個特性，我們將數種不同的帶磷酸特別化合物，快速結合到鍍鋁玻片表面，製造出了兩種不同的醣晶片: 共價結合醣晶片與非共價結合醣晶片。 針對非共價結合醣晶片，我們使用多氟化合物製造出高疏水性但高氟親合性的表面。 接著，將帶氟的醣分子轉移到非共價結合醣晶片上。利用質譜儀，我們能夠去分析晶片上醣分子的分子量變化。擁有如此方便的特性，我們將能分析許多醣轉移酶或是醣分解酶的活性。 針對共價結合醣晶片，帶有磷酸的醣分子直接被結合到晶片表面。利用金屬表面所帶來的高度反射性，螢光訊號將能夠被高度放大，如此我們能夠分析許多以前無法分析的抗體-抗原結合反應。 利用所建立的分析平台，我們針對愛滋病毒的廣效中和性抗體，進行了深入的探討。其中PG16 和PGT141-144 抗體，皆第一次經由完整的多醣資料庫而被分析出抗原的專一性。另外針對PG9抗體，我們完整分析出非常特別的多抗原結合反應。而這些新發現的抗原組合，將能夠為將來的愛滋病毒疫苗設計，帶來相當程度的幫助。
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在過去二十年中，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)在亞洲族群中是造成肝膿瘍的主要微生物之一。由於這類型的肝膿瘍通常會併發敗血症、菌血症、轉移性腦膜炎或眼內炎，所以其造成的死亡率也是很顯著的。臨床的研究結果顯示K1以及K2這兩種莢膜血清型的菌株是導致肝膿瘍的主要菌株,大約佔了50-85%。本研究的主要目標是去建構一種以莢膜多醣和蛋白接合在一起的疫苗，期望能有效預防經由克雷伯氏肺炎菌所導致的肝膿瘍。一般來說，由於莢膜多醣是一聚合物，其分子量和長度過於龐大，所以無法有效率地與攜帶蛋白(carrier protein)接合，不過藉由去聚合化作用將可以提昇接合的效率。在我們之前的研究中顯示，藉由化學的方法進行切割將會導致莢膜多醣上的修飾基例如：乙醯化、丙酮酸化的分離，這將使莢膜多醣失去其引發免疫反應的功用。 在我們現在的研究中，我們將建構好的噬菌體K1裂解酶(K1 lyase)表現以及純化出來。其相對活性可以藉由波長232nm的改變來測量。其最適pH值以及溫度分別是7.5以及30℃。鎂離子對於K1裂解酶的活性有實質上的幫助，不過其角色也可以被鈷離子或鎳離子所取代。我們也建構了可以更穩定且有效率的對莢膜多醣做切割的K1裂解酶突變株。藉由質譜的分析我們可以證實藉由K1裂解酶的作用我們可以對莢膜多醣進行切割卻不會使修飾基與之分離。同時我們也使用毛細管電泳(capillary electrophoresis)動態地偵測被切割後的莢膜多醣片段。
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當病原體感染發生在生物體中，許多細胞因子或即早基因，應迅速，準確地打開和關閉以進行免疫反應。嚴格地控制這些基因表現對預防免疫系統疾病是非常重要的。而利用RNA結合蛋白參與的轉錄後調控則是細胞用來操縱基因表達的策略之一。異質性核核糖核蛋白K，擁有三個可與RNA結合的KH（K-homology）結構域，並常涉及在調控後轉錄和轉譯的過程。為了研究hnRNP K在免疫反應中可能的功能，在脂多醣（LPS）處理過的小鼠RAW264.7巨噬細胞萃取物中以hnRNP K抗體進行RNA免疫沉澱。兩個即早基因：Tistetraproline（TTP）和腫瘤壞死因子-
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迴避死亡及癌細胞組織浸潤轉移是癌症的兩大特徵，在我論文的第一個部 份，主要是針對一種抑制癌症的細胞死亡形式—細胞凋亡的機探討，我們發現真 核轉譯起始因子 3k (eIF3k) 在表皮細胞中具有調控細胞凋亡的角色。eIF3k 已知 為 eIF3 複合體中的一個次單位，除此之外，在我們的研究中發現 eIF3k 會表現 於角質中間絲細胞骨架（keratin intermediate filaments）上，並與 18 號細胞角質 蛋白（K18）作結合，一旦啟動細胞凋亡的機制，eIF3k 會藉由與 keratin的作用進 入含有 K8 及 K18 的包含體中。先前已知這些含有 K8 及 K18 之包含體具有延 緩細胞凋亡進行的功能，可以擒住一部份的半胱氨酸蛋白（caspases），降低其與 受質接觸的機率，進而延緩細胞凋亡之進行。本研究發現 eIF3k 藉使 caspases 自 包含體釋放出來，進而促進細胞凋亡的進行。因此，本研究發現因此，本研究發 現 eIF3k 在細胞中不僅會與 eIF3 複合體結合，亦會與 keratin 結合，展現其不 同於 eIF3 複合體之特性，並藉由此種交互作用執行其特殊之生理功能，進而調控 細胞凋亡之進行。 接下來，在我論文的第二部份，主要是針對在結直腸癌 (CRC) 中，微型核糖 核酸 (microRNA) 對腫瘤轉移的調控機制探討，我們發現微型核糖核酸 103 號及 107 號 (miR-103/107) 具有促進腫瘤轉移的功能。首先，在一系列結直腸癌細胞 株中，我們發現 miR-103/107 的表現量與各細胞株的轉移潛能有正相關的現象， 且 miR-103/107 促進細胞移動能力，促進細胞與基質的黏附以及抑制細胞與細胞 之間的黏附等，在在皆顯示出 miR-103/107 可促進各種腫瘤轉移相關的特性，且 這些特性也被發現是透過抑制死亡相關蛋白激酶 (DAPK) 及 Krüppel 樣因子4 (KLF4) 所達成的。更重要的是，在缺氧情況下能促進細胞移動轉移的現象這條訊 息途逕也參予其中。最後，我們利用原位 CRC 腫瘤模型，再次應證了 miR-103/107 可透過抑制 DAPK 及 KLF4 的交互作用而達到促進 CRC 之腫瘤轉移。 總結，我們的研究發現了 eIF3k 具有調控細胞凋亡的功能以及探討了 miR-103/107 對腫瘤轉移的影響，期望對於腫瘤進程的研究能帶來幫助。
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蛋白質醣修飾的改變在癌症進程中扮演重要的角色，包括細胞增生，細胞侵犯，細胞轉移…等。我們利用超量表現第四型岩藻醣轉酶(fucosyltransferase IV, FucT4)的肺癌細胞株(A549-FucT4)及其對照組細胞株(A549-Mock)作為實驗的模式細胞，以探討第四型岩藻醣轉酶對於細胞的影響。根據先前研究結果指出，第四型岩藻醣轉酶大量表現使得A549-FucT4細胞株在轉移盤移行實驗(transwell migration assay)、細胞貼附實驗(adhesion assay)、明膠酶譜實驗(zymography)和免疫缺陷型小鼠(SCID mice)體中增殖實驗中皆發現較A549-Mock細胞株表現更惡性。本研究中利用兩種不同方式的嗜醣蛋白親和純化法(lectin affinity enrichment)分離出許多具有岩藻醣修飾之醣蛋白，經由液相層析串連電灑游離飛行式質譜儀(LC/ESI-TOF-MS)鑑定醣蛋白身分。根據比對A549-FucT4及A549-Mock細胞株中的醣蛋白，找出14個具有差異的岩藻醣修飾之蛋白。經過綜合生物分子分析軟體(IPA)運算之後發現這14個醣蛋白分別參與細胞增生，細胞貼附，細胞移動，細胞凋亡癌症相關功能。另外在實驗中我們發現A549-FucT4細胞株的生長速度比A549-Mock細胞株快。因此藉由醣蛋白質體學的實驗結果選出參與細胞增生的醣蛋白HGFR及CD109。結果指出，在不同濃度HGF刺激下或經過不同時間後，A549-FucT4細胞株的HGFR磷酸化程度均小於A549-Mock細胞株。但利用TGF-beta 1 處理細胞後，下游訊息smad3蛋白的磷酸化並無顯著差異。實驗結果讓我們瞭解到第四型岩藻醣轉酶大量表現會對癌症進程中的特定蛋白造成功能上的影響。
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Sda β-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase Ⅱ(β4galNAcTⅡ,人類中為B4GALNT2；老鼠為B4galnt2)此一醣轉移酶主要催化轉移GalNAc以β-1,4的鍵結，至[Neu5Acα2-3]Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal之Gal上，形成Sda結構。此一結構最早是在血球表面抗原結構所發現，實際上它廣泛存在於哺乳動物組織或體液中，包含胃、腸、腎、血清、尿液和乳汁等，近期研究發現人類胃癌和結腸癌細胞中B4GALNT2表現量會明顯下降，而使Sda抗原減少並與癌細胞轉移有密切關係。由此可知B4GALNT2的重要性與生物系統的相關性，但目前為止對其生理功能研究仍有很大的空間。2003年Dell的研究團隊首先在雌性生殖系統中發現Sda結構的存在，並由實驗室成員的研究了解B4galnt2和老鼠胚胎著床有關。本論文希望能進一步探討B4galnt2在其它雌性生殖器官中的生理特性，以便深入了解Sda結構在生殖系統中的重要性。 實驗以雌鼠為模式動物，首先確定B4galnt2在卵巢的表現，並測得Sda結構在卵子中存在，卻未能在卵丘細胞上表現Sda結構，進一步觀察B4galnt2在卵巢所排出的卵丘卵母細胞複合體(COCs)的表現位置，發現B4galnt2表現在卵丘細胞的細胞膜上。利用B4galnt2抗體觀察到B4galnt2可能對卵丘卵母細胞複合體中的卵子發育(oogenesis)成熟的關鍵步驟─卵丘擴張作用(cumulus expansion)有促進作用，綜合證據顯示卵丘擴張作用不僅需要促濾泡成熟激素(FSH)也需要B4galnt2蛋白存在。推測B4galnt2於卵丘擴張作用中與細胞移動有關，進一步探討B4galnt2和細胞移動能力的關連，利用以siRNA重組質體轉染有表現B4GALNT2之結腸癌細胞株HCT116測得細胞移動的降低，但抗體對其移動能力卻無影響；同時以HCT116、CaCo-2、SW480細胞株探討B4GALNT2抗體對於細胞移動能力的影響，結果也顯示無明顯差異。
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根據世界衛生組織統計，在人類眾多癌症中，十大死因排名第三名的疾病。在臨床檢體的分析中，惡性的肺癌細胞周邊組織及血清會表現較大量的第四型岩藻糖轉酶，其功能為將岩藻糖以α-1,3/4 的方式接上N-乙醯葡萄醣胺(N-acetylglucosamine)為核心的N端連結糖蛋白。岩藻糖基化是屬於轉錄後修飾中糖基化的一部分，由於岩藻糖基化的增加，導致細胞表面特定糖結構大量表現，會影響細胞內外的訊息傳遞、細胞貼附能力以及細胞與細胞間的辨識功能。在先前的研究中，利用已建立穩定表現第四型岩藻糖轉酶的肺腺癌細胞株(A549-FutIV)與轉入空質體的肺腺癌細胞株(A549-Mock)比較，發現當中有十九種N端連結的膜蛋白上，有較多或較少的鹽藻糖基化現象。在這十九種N端連結糖蛋白中，大部份蛋白的功能並未明確被研究出。 在本篇研究裡，我們想要去探討關於這些岩藻糖基化改變的膜蛋白與癌症的惡性轉移之間的關係，利用小干擾核醣核酸將特定基因的信使核醣核酸分解，達到蛋白質表現下降，來探討SLC3A2, CD166以及CD44對於癌症轉移的影響。由於CD166與CD44的表現量對於癌症惡性程度是有相關性，當CD166，CD44基因敲除後，對於癌症轉移能力有顯著性的減少，CD166本身與細胞外基質的結合能力透過實驗得知其具有貼附能力。SLC3A2本身為氨基酸轉運子重鏈，在纖維連接蛋白的聚集上扮演調控的角色，同時，在腎細胞癌中扮演著生物標記。由實驗結果得知，SLC3A2對於癌症的轉移能力並無顯著性的差異，但確實對於纖維連接蛋白擁有貼附能力。CD44基因敲除後，雖然會抑制惡性癌症的轉移，但並非因細胞外基質的貼附能力所致。結合侵犯實驗及貼附實驗發現，SLC3A2的貼附能力對於易轉移之癌細胞有抑制功效，CD166及CD44所造成的抑制癌症轉移效果並非經由貼附能力所致。
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Lon蛋白酶是一個單一聚合且多功能的酵素，它被高度的保存在生物種之間。Lon蛋白酶分為兩種亞型，LonA及LonB。它們保有ATPase domain歸屬於AAA+ superfamily之中並利用serine-lysine catalytic dyad 作為酵素的活性位置。LonB不同於LonA其具有N端的區段反而具穿膜區塊使之可鑲嵌在細胞膜上。Lon蛋白酶可調節生物體中新陳代謝的過程，適時降解目標蛋白以維持蛋白質的功能與結構的完整性。本篇論文選擇台灣本土嗜熱菌Meiothermus taiwanensis (WR-220)，選殖出兩個Lon蛋白酶MtaLonA1(793 a.a)、MtaLonA2(815 a.a)並建構其特異區塊酵素MtaLonA1N (1-312 a.a)、MtaLonA1A (313-585 a.a)、MtaLonA1α (492-585 a.a)、MtaLonA1C (586-793 a.a)、MtaLonA1NA (1-585 a.a)、MtaLonA1AC (313-793 a.a)、MtaLonA2N (1-320 a.a)、MtaLonA2A (321-601 a.a)、MtaLonA2α (508-601 a.a)、MtaLonA2C (602-815 a.a)、MtaLonA2NA (1-601 a.a)、 MtaLonA2AC (321-815 a.a)，透過表現與純化探討其結構與功能的特性，進而比較MtaLonA1及MtaLonA2的差異。 結構方面，利用原二色偏光儀分析呈現，所有蛋白皆以α-螺旋為主要的二級結構並且具有完整的三級結構。進一步利用AUC算得MtaLonA1及MtaLonA2分別形成六聚體及四聚體，於原態膠體電泳實驗中，MtaLonA1N、A1NA、MtaLonA2N、A2NA特異區塊酵素具有多聚體的結構。活性方面，MtaLonA1具有Protease、Peptidase、ATPase、Chaperone-like活性；然而，MtaLonA2具有Protease、ATPase、DNA-binding及較弱的Chaperone-like活性。在MtaLonA2的特異區塊酵素中，只有MtaLonA1N不具有DNA-binding的活性；MtaLonA2α呈現較弱的DNA-binding能力。尤其是MtLonA2AC呈現Protease、Peptidase活性及些許的ATPase活性。所有具有N端的蛋白(MtaLonA1N、A1NA、A2N、A2NA)皆有Chaperone-like活性，藉由此結果推斷出N端的序列對於結構聚合及Chaperone-like活性是必要的。我們並發現MtaHUβ為MtaLonA2特有的目標蛋白。基於這些實驗的結果，我們提出MtaLonA1及MtaLonA2具有不同的功能，更重要的是找出特異性的目標蛋白並結晶出完整長度的Lon蛋白酶，以深入了解MtaLonA1及MtaLonA2在生物體之中所參與的細胞調解。
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乳癌為全球婦女最常被診斷為惡性腫瘤的癌症，大部份(大於75%)的乳癌具有雌激素受體。雌激素目前已廣泛地被認為會促成腫瘤生成及腫瘤惡化。此外，在臨床上已普遍地偵測到乳癌患者的caspase-3在表現量有下降的情形，也被推論為是造成抗藥性的可能機轉。然而，目前對於造成caspase-3表現量下降的分子機轉仍不明瞭。在這份研究中，我們對雌激素促使腫瘤生成及腫瘤惡化是否是經由造成caspase-3表現量下降進行探討，並深入探討在乳癌細胞中雌激素造成 caspase-3表現量下降的分子機轉為何。 我們發現以雌激素處理乳癌細胞，會使得具雌激素受體的T47D乳癌細胞產生caspase-3表現量下降及多重抗藥性的情形，而不具雌激素受體的MDA-MB-231乳癌細胞則不會有這種現象發生。目前已經有報導指出以雌激素進行處理會造成miR-let-7a1表現量的上升，同時也有報導指出miR-let-7a1可藉由標的caspase-3而抑制治療所引起的細胞凋亡。我們也發現在我們處理細胞雌激素時，miR-let-7a1的表現量有上升的趨勢，同時強迫表達miR-let-7a1的T47D也產生caspase-3表現量下降及多重抗藥性的性狀。因此，我們想進一步釐清雌激素是如何促使miR-let-7a1表現量提升的分子機轉。不同於我們用IPA軟體所預測的結果，我們發現c-Myc/ERα複合體可能不是或非主要造成miR-let-7a1表現量上升的原因。由於在miR-let-7a1的promoter區域具有雌激素受體α的結合位點，之後必須進行ChIP的實驗去釐清雌激素受體是否會直接結合在這個區域進而促其表現上上升。 在我們的實驗中，我們發現活化態的caspase-7(p19/p12)在caspase-3表現量下降的乳癌細胞中表現量有提升的趨勢，同時雌激素所引起的caspase-3表現量下降的T47D也具有相同的性狀。我們進一步依循IPA軟體的預測去探討其可能的分子機轉為何。然而，STAT3及RB1兩者在以雌激素進行處理T47D時，都沒有產生明顯入核的情形。於是，我們進一步分析caspase-7的promoter區堿，發現其上也具有雌激素受體的結合位點。之後必須進行ChIP的實驗去釐清雌激素受體是否會直接結合上caspase-7的promoter區域進而促其表現上升。 目前我們實驗室已經發現蛋白質間交互作用的抑制劑I-Lys可以打破XIAP: p19/p12-casp7複合體的交互作用，進而促使惡性乳癌細胞走向細胞凋亡。 在我們的實驗中，我們也發現相較於未經處理的細胞，雌激素所引起的caspase-3表現量下降的T47D對I-Lys較為敏感。由目前所得到的結果可得知雌激素如何促使腫瘤生成及腫瘤惡化及雌激素如何調節乳癌細胞中caspase-3表現量下降而caspase-7表現量上升的情形。此外， XIAP:p19/p12-casp7複合體也可以作為對抗caspase-3表現量下降的惡性腫瘤的標靶。值得注意地，我們也建議醫療上以激素替代療法（HRT）的治療停經後婦女以防止由於雌激素水平下降的不適時需格外地小心。
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消化道系統相關癌症癌化的過程會伴隨癌細胞表面醣結構的改變，這些特定出現於癌細胞表面的醣稱為腫瘤相關醣抗原(tumor-associated antigens)；sialyl Lewis a (sLea)與sialyl Lewis x (sLex)是最著名的消化道系統相關癌症的腫瘤相關醣抗原。過去的研究證實，sLea與sLex會促進消化道系統相關癌症的癌細胞轉移(metastasis)，且此二醣抗原的表現和術後癌症復發與病人存活率有很大的關係。sLea與sLex建構於重複的N-acetyllactosamine (Gal-GlcNAc，LacNAc)單元所組成的poly-LacNAc鏈的末端。本實驗室過去的研究發現，大腸癌病患的大腸腫瘤組織中，兩個參與poly-LacNAc鏈建構的基因，β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 7 (B3GNT7)與I-branching β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (IGnTA)，其表現相較於正常大腸組織降低許多。因此， poly-LacNAc鏈的生合成出現問題，是否會改變sLea與sLex的表現，進而影響大腸癌細胞轉移，是我們想要探討的問題。 本研究以大腸癌細胞株做為研究的細胞模型，探討B3GNT7與IGnTA的表現對於大腸癌細胞轉移的影響，並進一步探討造成此二基因於大腸癌細胞中表現降低的機制。我們的研究發現，大量表現B3GNT7與IGnTA的大腸癌細胞，會分別降低其細胞表面sLex與sLea的表現；裸鼠實驗中，大量表現B3GNT7與IGnTA的大腸癌細胞，其癌細胞轉移的情況相較於對照組降低許多。我們也發現大腸癌細胞的B3GNT7與IGnTA的5端調控區域有高度甲基化的現象，並且利用去甲基化藥物5-Aza-2’-deoxycytidine (5AzadC)可回復大腸癌細胞中此二基因的表現與降低B3GNT7與IGnTA的5端調控區域的甲基化程度，顯示大腸癌細胞調控此二基因表現的機制與DNA甲基化有很大的關係。進一步地，我們發現利用epigenetic藥物，包括5AzadC與組蛋白去乙醯酵素抑制劑(HDAC inhibitors)，可增加大腸癌細胞中IGnTA的表現，並降低其細胞表面sLea的表現。 我們的研究證實，大腸癌細胞中B3GNT7與IGnTA表現降低的原因與DNA甲基化有很大的關係，而此二基因表現的改變，將影響細胞表面醣抗原的表現，進而可能於大腸癌轉移的機制中扮演重要的角色。