國立臺灣大學生化科學研究所學位論文/Institute of Biochemical Sciences
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Lon 蛋白脢是一種需要ATP來進行其活性的酵素，Lon 蛋白脢屬於AAA+ 超級家族的成員之一，這些Lon 蛋白脢主要分成兩種群體， Lon A 以及 Lon B，然而在最近的研究中指出，一種新的Lon 蛋白脢被鑑定出來，被稱為Lon C蛋白脢，這是一種不需要ATP就可以執行其活性的蛋白脢酵素，我們的實驗團隊從一 種中度嗜熱菌分離出LonC蛋白脢，稱為MtaLonC， 並且將分離出的MtaLonC 以基因工程的方法重新純化出重組蛋白，並且將MtaLonC的結構所解出來， MtaLonC形成一種類似桶狀的結構，並且開口與出口相通形成中空相連的結構， 由此結構可以指出MtaLonC的N-端區域與一種類似AAA+的結構相連接，而 MtaLonC的N-端區域的序列與其它種Lon蛋白脢分析過後發現無相似之處，而 在此全長結構的N-端區域缺少一部分的電子密度圖，並推測結構可能具有可變 性•為了將缺少電子密度圖的N-端結構解出以及了解其功能，MtaLonC的N-端 區域的重組蛋白被建構出來並且將其蛋白進行結晶，以進行X光散射實驗， MtaLonC的N-端區域晶體的散射數據達到2.4 A，並且成功的利用多波長散射來 解出結構，此解出的結構呈現一個巨大的ɑ-螺旋髮夾結構(HHE)從AAA+相似結 構所突出•研究結果顯示這種可變性的HHE結構與不完整結構蛋白的結合以及辨 識有關，並且防止不完整結構蛋白互相聚集，因此MtaLonC不只是一種降解機器 也扮演著蛋白質監控者的角色•
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細胞自噬作用是一種大分子物質的分解機制，細胞藉由自噬體其雙層膜狀構造包圍細胞質的物質，並和溶小體融合以分解物質，其整體過程受一組稱為ATGs的基因控制著。同時，細胞自噬作用在細胞存活、生長調控和蛋白質代謝中，扮演十分重要的角色，更維持細胞物質合成、分解和循環的平衡。酵母菌ATG8在哺乳類細胞內的同源蛋白LC3，是一種類泛素蛋白，其間介自噬體膜的連結與半融和，並在自噬體的形成具有無可取代的重要性。游離於細胞質的LC3-I與自噬體膜上的磷脂醯乙醇胺(Periyasamy-Thandavan, Jiang et al.)共價結合形成LC3-II，並調節自噬體膜的形成與延伸。另一方面，半胱胺酸蛋白酶ATG4B在自噬作用中是一個關鍵的酵素，其可和兩種LC3作用，首先，ATG4B 可切割LC3前驅蛋白的C端片段產生LC3-I，另外，A TG4B也會和自噬體膜外的LC3-II作用，LC3-II被移除並轉換回LC3-I，使細胞自噬作用得以進行。因此，ATG4B調控著整個自噬作用的過程，細胞到底是如何嚴格的控管ATG4B活性呢? 觀察ATG4B和LC3-I複合體的結構，我們推測LC3-I可能會和ATG4B結合。為證實ATG4B和LC3-I的交互作用，我們利用等溫滴定微量熱法證明ATG4B和LC3-I的結合，以西方墨點法觀察與定量內生性ATG4B、LC3-I濃度的變化驗證細胞內的反應，再以酵素動力學探討LC3-I和ATG4B的關係，另外在螢光顯微鏡下，觀測細胞內ATG4B對GFP-LC3分佈的影響。 實驗發現， 除LC3前驅物，ATG4B也可與LC3-I結合，且親和力更好，ATG4B作用的速率隨著LC3-I濃度的升高，逐漸下降，透過實驗結果得到LC3- I對ATG4B有競爭型抑制作作用，證明LC3-I和ATG4B在細胞自噬的相互作用。此外，在細胞過量表現ATG4B也使GFP-LC3產生在細胞質聚集的現象，因此，我們推論在正常環境下，游離在細胞質的LC3-I會和ATG4B交互作用，抑制ATG4B的活性；當細胞遇到生存壓力誘發細胞自噬作用時， LC3-I轉換成LC3-II的比例增高，使細胞質的LC3-I減少，激活ATG4B移除自噬體膜上的LC3-II，促使自噬體與溶小體融合。
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細胞融合和細胞入侵在胎盤發育的過程扮演重要且不可或缺的角色。絨毛膜絨毛(chorionic villi)上的滋養葉胞層細胞 (cytotrophoblast)可透過細胞融合分化成多核的滋養葉融合層細胞 (syncytiotrophoblast)，進而幫助養份和氣體的交換,另一方面，滋養葉胞層細胞透過分化形成外絨毛滋養細胞 (extravillous trophoblast)，促使滋養細胞入侵到子宮組織，幫助母體和胎兒血液循環系統的交通。在我們過去的研究中發現，人類胎盤特殊轉錄因子GCM1 (Glial cells missing homolog 1)可透過控制融合蛋白syncytin-1和syncytin-2的基因表現來調控胎盤滋養葉細胞的細胞融合。值得一題的是，GCM1和syncytin-1蛋白都會在外絨毛滋養細胞中表現，然而，我們卻不知道它們在生理上的功能。為了探討此一問題，我們首先在胎盤細胞中證實GCM1具有促進胎盤細胞入侵的功能。我們進一步利用染色質免疫沉澱技術結合晶片分析(ChIP-chip analysis)，鑑定發現HtrA4 (high temperature requirement A4)是GCM1獨特的標的基因，HtrA4蛋白具有絲氨酸蛋白酶的活性，透過切割fibronectin可幫助胎盤細胞的入侵功能。重要的是，透過免疫組織染色方法偵測到HtrA4蛋白位於胎盤和子宮的接觸面，並且發現HtrA4蛋白在缺氧環境的細胞和子癇先兆症病患的胎盤表現量明顯減少，顯示缺氧環境下HtrA4蛋白的減少可能造成外絨毛滋養細胞淺層入侵子宮組織，進而導致子癇先兆症。我們更進一步證實，HtrA4蛋白可直接和syncytin-1蛋白的SU區域結合,達到抑制細胞融合的功能。因此，HtrA4蛋白可能透過抑制細胞融合和促進細胞入侵的雙重角色，完成調控外絨毛滋養細胞分化的功能。在我們的研究中揭露了GCM1和HtrA4蛋白的新功能，具有調控外絨毛滋養細胞入侵的能力，並且證實異常HtrA4蛋白的表現可能導致子癇先兆症的形成。
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岩藻醣水解酶 (α-L-Fucosidase) 是負責水解非還原端上各種含有岩藻糖修飾的醣類分子並釋放出L-fucose。人類有兩種岩藻醣水解酶 (EC 3.2.1.51) ，分別為第一型岩藻醣水解酶 (簡稱FucA1) 和第二型岩藻醣水解酶 (簡稱FucA2) 。諸多疾病會有岩藻醣水解酶活性異常的現象，先前本實驗室的研究發現，當人類癌症細胞受到胃幽門螺旋桿菌感染時，會促使FucA2分泌至細胞外。而FucA2在感染過程中所扮演的角色與生化性質目前仍不清楚。 為了瞭解FucA2的生理意義，探討其生化特性是很重要的一部份。本研究首次在大腸桿菌建構具有融合蛋白的FucA2質體，並成功表現出有活性且大量的FucA2，檢測其pH值對活性之影響、酵素動力學常數、受質專一性等性質，並與FucA1作比較。這二個酵素的pH 值活性分布有異，FucA1最佳活性落在pH 4.5 及pH 6.5而FucA2則落在pH 6.0。接著用含螢光的寡醣鏈與細胞萃取之醣鏈檢測受質專一性，發現FucA1可水解 Fuc α-1,2 Gal β-1,4、core Fuc α-1,6 bi/triantennary、Lea、Lex受質上的岩藻醣，而且FucA1對於細胞上萃取之後的醣鏈上之core Fucose有非常好的水解活性，FucA2則水解Fuc α-1,2 Gal β-1,4、core Fuc biantennary、Lex受質上的岩藻醣。 另外諸多研究報告癌症病人的血漿中含有高度的岩藻醣水解酶活性，為探究此生理現象的活性來源，本研究自萬芳醫院取得癌症病人的血漿進行分析，並利用實驗室合成的抑制劑層析管柱純化出岩藻醣水解酶，再以中研院單多株抗體生產中心所生產的專一性抗體來作確認。經實驗證實肝癌病人血漿中高度的岩藻醣水解酶活性來自於FucA1，而且發現其上具有轉譯後修飾作用，以凝集素微陣列分析發現該修飾為含有Fuc之N-glycosylation，而正常人血漿中岩藻醣水解酶則屬於FucA2，其修飾則偏向O-glycosylation。顯示FucA1有潛力作為腫瘤指標，而單多株抗體生產中心所製備的anti-FucA1 IgG則可應用於臨床研究並作為診斷工具。
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FHA (forkhead-associated) 是一種新發現的結構域，它可以專一性地結合磷酸化蘇氨酸，並藉此調控細胞內許多重要的機制。TIFA是所有已知人類蛋白質包含FHA結構域中最小的一個。先前的文獻已經發現在細胞中大量表現外源性TIFA會激活轉錄因子NF-kappaB，不過TIFA如何參與並調控這訊息傳導仍需要更深入的探討。在此研究中, 我們在TIFA上發現了一個蘇氨酸(第九個氨基酸)有被磷酸化修飾，並證實這個磷酸化蘇氨酸會與TIFA的FHA結構域結合。此交互作用會促進TIFA蛋白質間的聚合並激活下游的NF-kappaB。生化分析的結果顯示在緩衝溶液中，未磷酸化的TIFA是以二聚體的形式存在著，意味著TIFA FHA結構域和第九磷酸化蘇氨酸(pT9)間的結合是TIFA二聚體與二聚體間的交互作用。此外，我們也發現抑制內源性TIFA會削弱細胞激素TNF-alpha引發的訊息傳遞及其功能。根據這些結果，我們認為TIFA FHA-pT9的交互作用是TNF-alpha刺激後活化NF-kappaB傳導途徑中未知的新環節，而此TIFA二聚體分子間藉由FHA-pT9結合形成聚合體的機制，將是FHA結構域研究中另一個全新的範例。
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CTCF 是一個分佈廣且高度保守的轉錄因子，其分子量約82 kDa。先 前證實獲能的小白鼠精子之CTCF 會在酪胺酸基磷酸化。本研究探討這一 個巨大蛋白分子的酪胺酸磷酸化位置，並評估該化學修飾對標的核酸親和 力的影響。我們發現頂體反應不會導致存於頂體內CTCF 的釋放。運用基 因重組技術，融合GST 於CTCF 三個區域（domain），包括鋅指部位 （Zinc-finger domain，ZD/ residues 266-573），ZD 的N-端區域（ND/ residues 1-265）和ZD 的C-端區域（CD/ residues 574-736）。GST-ND 可被獲能精 子的酪胺酸激酶活性磷酸化，但GST-ZD 和GST-CD 卻不會。進一步將ND 的Y25, Y138, Y197, Y214, or Y226 突變成苯丙胺酸（Phenylalanine）而製備了突變 蛋白。相對原始蛋白（wild-type GST-ND），Y25F、Y138F 和Y214F 具有 相同的激酶基質活化，但Y197F 和Y226F 的基質活性則顯著降低，提示 Y197F 和Y226F 是兩個主要的磷酸化位置。進一步發現EGFR 的抑制劑 AG1478 可降低激酶對GST-ND 的磷酸化。配合可被磷酸化酪胺酸鄰近胺 基酸順序預測Y197 可被EGFR 磷酸化。運用核酸電泳動移動分析法 （electrophoretic mobility shift assay）量測CTCF 對β-APP、FpV 和c-Myc 啟 動子的親和力。相對於尚未獲能精子的CTCF，獲能精子的CTCF 對三個 啟動子的親和力較弱，但對甲基化的啟動子則親和力較強。
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岩藻糖水解酶屬於醣苷酶，首先於溶酶體內發現，負責切除醣複合物非還原端的岩藻糖。岩藻糖水解酶不正常地自細胞內分泌至細胞外液，與許多疾病進程相關，例如結腸癌、子宮頸癌和肝癌。血清岩藻糖水解酶活性在肝癌病患顯著高於健康正常組，酵素活性被認為是肝癌早期診斷的生物標誌物候選蛋白質。 先前本實驗室報導1-amino-1-deoxymethyl fuconojirimycin (FNJ) 和其衍生物是岩藻糖水解酶的有效抑制劑，抑制常數在μM 至 pM 範圍。本論文建構了簡單快速的方法，用於純化鑑定肝癌血清中的岩藻糖水解酶。主要將 FNJ 與活化載體上的 carbonyl diimidazole 耦合形成醯胺鍵，我們使用兩種載體，分別為瓊脂醣和磁性奈米粒子。以高效液相層析儀定量耦合釋出的 imidazole，計算出耦合產率約 70%。珠體的酵素結合能力，由結合後剩餘的岩藻糖水解酶活性決定，最佳結合能力為磁性奈米粒子每微莫耳活化位，結合約 326.5 微克的岩藻糖水解酶。含 0.5% SDS 的溶離液具有岩藻糖水解酶最高回收效率約 90%。這個純化方法應用在純化大腸桿菌粗抽液中的岩藻糖水解酶，以及人類血清中的酵素。在肝癌病患血清，鑑定出其內岩藻糖水解酶活性異常增高的主要酵素為溶酶體的岩藻糖水解酶。根據凝集素微陣列分析，初步純化之病患血清岩藻糖水解酶，可能具有 Fuc 相關的 N- 醣基化後修飾。抑制劑為主的親和性層析方法，同時應用在闡述幽門螺旋桿菌感染胃腺癌細胞後，共培養液中活性大量表現的葡萄糖苷酶種類。本研究證實抑制劑親和性層析方法為快速經濟的純化方法，有效應用於不同的複雜生物樣本。
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先天免疫系統招募各種穿膜及細胞質中生殖系編碼 (germline-encoded)的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs) 來偵測外來病原的pathogen-associatedmolecular patterns (PAMPs)，像是脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS), 肽聚醣(peptidoglycan, PGN),鞭毛(flagellin), 核酸(DNA) 及CpG DNA. 這些被PAMPs 刺激的受體便會啟動細胞內的訊息傳遞以達到宿主防禦的反應。 當PRRs 的leucine-rich repeat (LRR) 辨認到各種各樣的PAMPs, 細胞質中nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing receptors (NLRs)的N 端Pyrin domain (PYD) 利用它的homotypic 作用力使訊號傳到下游。PYD-containingNLRs (NLRPs)家族總共有14 個成員，而其中幾個發生突變跟人類發炎失調疾病息息相關。 人類的PYNOD, 亦稱NLRP10 是一個新穎的發炎負向調控者，其特徵是缺乏C端的LRR。通過它的PYD domain, PYNOD抑制ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)的聚合反應，使capase-1 的活化以及caspase-1 媒介的1L-1β 成熟化受到壓制。由於PYNOD 具有抗發炎性，從結構的角度了解它跟ASC的PYD-PYD 的結合模式是重要的。在本篇論文中，我主要研究PYNOD 的三維核磁共振結構和它的動態，結果顯示其外形是由6 個Helices 構成的桶狀構形，連接H2 和H3 有突出的loop L3。骨架動態數據發現這loop L3 及H3 比其他5 段Helices有相對性較高的彈性。
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在細胞中蛋白質的合成與降解是處於一個動態的平衡狀態，有新的蛋白質合成也有失去功能與無法正常摺疊之蛋白被降解。兩者之間的平衡一但被破壞將導致細胞的環境失去恆定性，導致細胞因此產生警示性的反應而引發細胞凋亡以及細胞癌化的可能。 在眾多調控細胞蛋白質和成與降解的機制中，有一群被稱為AAA+ protease family的蛋白脢。它們共有的特徵就是在其中具有ATPase的AAA+ module可以跟ATP結合與水解，因此產生蛋白質構形改變與用此能量來unfolding目標蛋白。它們通常是辨認目標蛋白於不正常摺疊時所露出的特定序列，通常以”degron”稱呼之。在細胞中它們如同品管人員一般，進行protein quality control以及決定特定蛋白在細胞中的表現水平。在AAA+ protease family之中有一類蛋白脢名為‘'Lon protease”，依照序列比對又可再細分為LonA、LonB與LonC三類。LonA由N端之N domain以及接下來的AAA+ domain與protease domain組成；LonB與LonC較為相似，LonB相較於LonA少了N domain但AAA+ domain有多出穿膜區段，LonC其AAA+ domain則是去活性的，在AAA+ domain上有延伸出一段 coiled-coil domain。其中LonA不論是原核與真核生物的胞器都可以發現它的存在。於真核生物中它存在於粒線體、葉綠體、過氧化體這些胞器，因此它在維持細胞能量代謝以及氧化壓力水平扮演著重要的角色。 到目前關於LonA完整的結構尚未解出，目前解出的多為獨立功能域的結構。因此在本篇研究嘗試以Meiothermus taiwanensis之MtaLonA1蛋白用於長晶，希望能拼湊出MtaLonA1蛋白完整的結構。雖然我們的確有長出MtaLonA1蛋白全長晶體，X-ray繞射之最佳解析度介於3~3.5A，但是晶格某一方向的軸異常的長(468.38A)，此晶體繞射品質尚在改進中。目前另採取其他策略把全長蛋白分成兩個蛋白用於長晶，其一為涵蓋N端至AAA+ domain之α/β sub domain；另一為去除N domain的蛋白。