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螢光蛋白基因轉殖魚在心臟疾病之研究

Four-and-a-half LIM domains(FHL) 蛋白家族在真核生物中具有很高的保守性，其結構是由四又二分之一個LIM domain所組成。LIM domain為一蛋白質交互作用motif，因此FHL蛋白能夠和許多蛋白質進行作用，包括structural proteins、kinases以及許多transcription factors，因此參與、調控了許多細胞內的活動，包括細胞存活、轉錄調控及訊息傳遞。其組織特異性的表現模式主要在骨骼肌及心肌中，因此FHL蛋白家族在體內扮演的角色主要是調控肌肉及心血管的發育及功能。 本實驗中，我們首先比較了人類、老鼠及斑馬魚的FHL蛋白胺基酸序列，顯示了高度的保守性。接著，由斑馬魚的whole mount in situ hybridization實驗所得到的結果顯示，FHL蛋白在心臟及部分肌肉皆有表現，意味著其在心臟的重要性。為了探討FHL蛋白家族對於班馬魚胚胎時期的心臟發育及功能之影響，利用實驗室所選殖出的三種FHL基因，包括FHL1、FHL2、FHL5，藉由心臟專一性表現之啟動子cmlc2過量表現於斑馬魚胚胎心臟中，並同時表達綠色螢光蛋白以利於觀察。結果發現，FHL蛋白過量表現之基因轉殖魚部分螢光斑馬魚子代產生心律不整、心跳減緩的情形，顯示FHL蛋白參與了心肌節律，調控心跳。為了嘗試治療心律不整之病症並進一步釐清FHL蛋白家族是否透過和β-adrenergic receptor signaling pathway產生作用而調控心跳，將表現不同組合FHL 蛋白之斑馬魚品系以isoprenaline此一強心劑進行處理，將5~6dpf的魚苗浸泡、飼養在不同濃度(0.01μg/μl、0.0075μg/μl、0.005μg/μl、0.001μg/μl)的isoprenaline中，並持續觀察。我們的研究結果發現，經由isoprenaline處理將可以有效地改善過表現FHL 蛋白所造成的心律不整。然而，在長時間處理之下，過表現FHL 蛋白的斑馬魚品系心律不整的情形將會復發，並且有顯著的死亡率上升。我們仍需更進一步實驗來探討此現象。 藉由本實驗，我們更清楚地瞭解FHL蛋白在心臟中之作用，以及其在心臟疾病中的角色，而我們的成果也成功地以斑馬魚建立了心律不整的生物模式，有利於將來相關藥物的篩選及開發。

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探討老鼠普立昂蛋白進行結構轉變時三段阿法螺旋扮演的角色

普立昂疾病是一類具傳染力且致命的神經退化性疾病，會侵襲中樞神經系統造成人類或動物腦組織產生海綿狀的病變。其致病物質為錯誤折疊的普立昂蛋白(PrPSc)，有容易聚集和傳染的特性。細胞中正常的普立昂蛋白(PrPC)是α螺旋為主的結構，會轉變成以β摺板為主的致病性普立昂蛋白(PrPSc)，而聚集成易沉澱的澱粉樣類纖維構造。這種不正常的結構轉變便是造成細胞毒性的主要原因。但是目前我們仍然不清楚普立昂疾病結構轉變的過程和致病機制。本實驗室在先前研究中發現雙硫鍵被移除的重組普立昂蛋白，可以在中性環境下進行自發性的結構轉變。它可以轉變成β寡聚體或者澱粉樣類纖維構造。為了探討不同區域的資訊，在這項研究中，我們先分別標定在普立昂蛋白的三個α螺旋上。接著，將標定的普立昂蛋白進行結構轉變，包括自發性結構轉變，形成β寡聚體以及形成澱粉樣類纖維構造。我們利用圓二色光譜和電子自旋共振(ESR)圖譜等技術來探討這些區域有無參與結構轉變。在自發性的結構轉變中，我們發現整體結構變得比較鬆散。另外，在β寡聚體的結構時，helix 1和helix 2的結構會部分解開，而helix 3可能維持在穩定的結構中。最後，在澱粉樣類纖維構造中，我們發現helix 3的分子間距離只有1奈米，但仍然需要進一步實驗來確認β摺板為主結構是由哪一區域轉變成的。

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探討PLK1磷酸激酶對GCM1轉錄活性之調控

人類 glial cell missing-1 (GCM1) 蛋白質為專一性表現在胎盤的細胞滋養層細 胞(cytotrophoblast) 和融合滋養層細胞(syncytiotrophoblast) 與絨毛外胎盤細胞 (extravillous trophoblast) 的轉錄因子，可調控syncytin-1，syncytin-2 與MFSD2A 蛋白質表現，促進細胞滋養層細胞產生細胞融合，進而分化成融合滋養層細胞； 也會調控HtrA4 蛋白質表現，促進絨毛外胎盤細胞的移動與侵入子宮內膜組織。 GCM1 透過調控樹狀絨毛與絨毛外兩類型胎盤細胞分化的路徑，以調控胎盤結構 的正常發育，使胎兒和母體間養分與氣體等物質交換達到最大效率。細胞滋養層 細胞為融合滋養層細胞的前驅細胞，具有細胞增生與分化的能力，而GCM1 轉錄 活性是否受到細胞週期所調控目前仍屬未知。過去實驗室利用蛋白質體研究GCM1 結合蛋白，其中發現polo-like kinase 1 (PLK1) 此一在細胞週期中扮演非常重要角 色的serine/threonine 磷酸激酶。 為了進一步了解 PLK1 是否調控GCM1 活性，首先利用免疫沉澱實驗確定了 GCM1 和PLK1 在細胞中的確有交互作用，而免疫螢光染色也觀察到GCM1 和 PLK1 在metaphase 的表現會有部分重疊在中心體的位置。在細胞外磷酸化實驗發 現，全長的GCM1 和其transactivation domain 1 (TAD1) 會受到PLK1 磷酸化。特 別地，當GCM1 和PLK1 在細胞中共同表現時，可發現GCM1 與含有TAD1 的片 段會出現有較高分子量的變化，推測可能是PLK1 促進GCM1 受到某種轉譯後修 飾。而在細胞外去磷酸化實驗中，排除了此較高分子量之GCM1 為磷酸化修飾所 造成。在胎盤細胞株的細胞週期同步實驗中可觀察到，此較高分子量之GCM1 的 出現與細胞週期有關。利用luciferase 冷光報導基因實驗也觀察到，PLK1 在胎盤 細胞株會抑制內生性GCM1 的轉錄活性，然而不具有磷酸激酶活性的PLK1 K82M 突變也會抑制GCM1 轉錄活性。隨著GCM1 轉錄因子所調控的標的基因在近年來 陸續被發現，探討PLK1 調控GCM1 活性的詳細機制，將有助於了解GCM1 在調 控胎盤發育與分化上的功能。

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探討丙酮酸對HEK 293細胞抗氧化能力之影響

組織缺血與再灌流(ischemia/reperfusion)是指血液供應受到阻礙與隨後的血流恢復，這種現象帶給細胞組織許多負面影響，其中粒線體失去正常功能而導致的氧化壓力將帶給細胞嚴重的傷害，在動物模式中發現外加高於生理濃度的丙酮酸可以有效的救援氧化壓力帶來的傷害。以往對於中間代謝的觀點只是提供細胞養分以及生合成的材料，然而，越來越多的證據顯示有些代謝物質可能扮演訊息傳遞的角色，這些代謝物質可能會藉著與目標蛋白的直接作用而影響其功能，為了驗證此觀點，本實驗室發展了能夠鑑定與丙酮酸直接作用的蛋白質體的方法學(AETHIC)，本研究利用AETHIC與代謝體分析，探討外加的丙酮酸對於HEK細胞抗氧化能力的影響，主要針對我們鑑定到的蛋白：檸檬酸合成酶以及硫氧還蛋白還原酶(TrxR)。前者與異檸檬酸脫氫酶(NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase, NADP+-IDH)所構成的代謝途徑可以產生細胞還原力的來源NADPH，而後者與抗氧化能力有直接的關係。 在代謝體分析中顯示丙酮酸加入HEK細胞培養液中導致檸檬酸循環流量的提高，另外NADPH/NADP+與NADH/NAD+也有明顯的增加，酵素活性分析結果顯示相同的處理下檸檬酸合成酶活性降低，所以檸檬酸合成酶活性的下降可看做對TCA cycle的調控。接著觀察檸檬酸合成酶的下游代謝：異檸檬酸脫氫酶，在in cellulo活性測試發現丙酮酸可以增加異檸檬酸脫氫酶的活性，但在in vivo實驗中，只在較丙酮酸高濃度下才觀察到，故推測細胞內有其他的機制來調控異檸檬酸脫氫酶活性。在硫氧還蛋白還原酶的研究中，觀察到氧化壓力會導致此蛋白的失活，但丙酮酸可以快速的恢復其活性至正常值，所以推測丙酮酸具有保護硫氧還蛋白還原酶的功效。由以上實驗顯示，丙酮酸對於細胞抗氧化壓力是有幫助的，可以快速增加細胞的還原能力，同時也有維持TrxR/Trx還原系統的功能。

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類黃鹼素對A431癌細胞的基質金屬蛋白酶分泌及侵襲性偽足形成能力之影響

轉移是癌症致死最主要的一個原因。癌細胞要達成轉移必須經過非常複雜的過程，其中第一步就是癌細胞必須穿越週遭細胞外基質的阻礙。侵襲性偽足(Invadopodia)是位於細胞膜上的微小突起，用於侵入胞外基質；近來有相當多的文獻指出其為主要聚集基質金屬蛋白酶(MMP)並釋放而使細胞可穿越胞外基質的關鍵結構。為了研究轉移的機制，本實驗室將A431子宮頸上皮癌細胞(A431-P)利用Boyden chamber進行篩選，經連續三次穿膜篩選出擁有較高入侵轉移能力之A431第三代細胞(A431-III)。藉由兩株細胞之比較，證明了A431-III具有較高的入侵、移動能力，並且表現較多量的基質金屬蛋白酶；這樣的A431系統提供了一個好的模型以研究癌細胞之轉移入侵過程。在本實驗中，利用A431-P/III的比較發現具強轉移能力的A431-III比起母代細胞形成較多的侵襲性偽足結構以幫助入侵並分解基質。進一步研究這樣的差異主要來自Src蛋白磷酸酶較高的活化程度以及對下游Cortactin蛋白較多的磷酸化。另外也確認了基質金屬蛋白酶(MMP)對於侵襲性偽足的重要性，其中MMP-9是最主要參與的蛋白酶種類。 類黃鹼素(flavonoid)是一群廣泛存在於植物性食物中的天然化合物。根據已發表的報告指出其有相當多的生物活性，其中包括了抗癌及抗癌轉移。本實驗室先前選出兩個具最高抗癌潛能的類黃鹼素:木樨草素(Luteolin)與槲皮素(Quercetin)，對癌細胞活性、生長及轉移具極佳抑制效果，並可抑制基質金屬蛋白酶分泌。鑒於侵襲性偽足對於癌細胞入侵的重要性，本研究證明了此兩種類黃鹼素可以有效抑制侵襲性偽足的產生及抑制細胞外基質的分解。其原因是由於類黃鹼素能抑制包括Src的活化及cortactin的磷酸化，進而抑制侵襲性偽足的形成以及聚集MMP之能力，最終達成抗轉移之結果。

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癌細胞中調控CCT-β表現程度對伴侶蛋白折疊與抗藥性之影響

近年來，對於癌症的運作機制已經越來越被研究透徹，治療方式也持續地有突破性的發展。然而，對於各式抗癌藥物，在長時間的治療下，癌症細胞所出現的抗藥性，仍然是癌症治療上難以突破的癥結點。Chaperonin containing t-complex polypeptide 1 (CCT) subunit β (CCT-β) 被發現在許多不同種類的癌症以及具抗藥性的癌症細胞中，都有過量表現的狀況(Lin et al., 2009)。因此在本論文中，我主要的目的即為觀察過量表現的CCT-β在癌症細胞中的特性，為此，我首先建立了CCT-β過量表現以及CCT-β抑制表現的兩種穩定細胞株，以觀察CCT-β在癌症細胞中所造成的影響。 首先檢視的，是CCT的蛋白質折疊能力。CCT的兩種受質actin與tubulin，是細胞骨架actin filament與microtubule不可或缺的組成物。在CCT-β過量表現的穩定細胞株中，actin與tubulin的兩種亞型均發現有顯著增加的情形，顯示過量表現的CCT-β能夠增加actin與tubulin的折疊及成熟。另一方面，CCT-

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N端螺旋結構域的陰電性變化如何影響細胞自噬蛋白LC3

細胞自噬普遍存在於真核生物細胞中。細胞會藉由細胞自噬的過程來清除較次要的有機顆粒、受損的胞器，甚至胞內的病原體，以換取必須能量、進行養份循環、完成免疫反應等。細胞自噬時，將被降解的物質首先會由一種稱作吞噬泡的雙層膜構造的擴展所包圍而後封閉，稱為自噬體。自噬體接著與胞內的溶酶體融合成自噬溶酶體，經由溶酶體的水解酶消化自噬體的內容物，並釋出降解後的產物回細胞質。細胞自噬已知與多種人類的病理過程相關，如神經退化、癌症及老化。 LC3是一種類似泛素的細胞自噬蛋白，連接並修飾著擴展過程中的吞噬泡表面。LC3經由一套類似E1-E3的酵素系統，與吞噬泡上的磷脂醯乙醇胺連結。LC3被認為藉由其自身的多聚化，能促使吞噬泡間膜的連結與半融合。先前的研究顯示LC3由兩個結構域構成：N端螺旋結構域(NHD)和C端的類泛素結構域(ULD)。當LC3與自噬泡上的脂質連結，其NHD可能會減少與ULD間的接觸面，而成一個「開啟」的形式，使得LC3得以暴露ULD的部分表面區域，誘發LC3行多聚化。 2010年的兩項研究顯示小鼠的蛋白激酶A與大鼠的蛋白激酶C各別能磷酸化LC3之第12號絲胺酸與第6號蘇胺酸。這暗示著可能存在一套未知的LC3調控模式，特別是藉由改變NHD在LC3上的動態。 本研究使用仿磷酸化的人類LC3突變型，T6D (將第6號蘇胺酸突變為天門冬氨酸)及T12D (將第12號蘇胺酸突變為天門冬氨酸)，來與野生型的LC3和重組的ULD比較，利用圓二色光譜技術(CD)，作為觀察LC3二級構造之集體行為的工具；以測試當NHD上存在帶額外負電荷的官能基時， LC3的動態或穩定性是否發生顯著改變，進而影響LC3的活性。 結果顯示相較於ULD，不論野生型或仿磷酸化的LC3，在波長222奈米附近皆具有較強且相似的CD訊號；α螺旋結構的存在會大幅提高此處的訊號，故當此結構消失或變性時，CD222訊號會大幅下降。利用在不同濃度的尿素與鹽酸胍下產生的CD222，來建立各種LC3的變性曲線，結果發現仿磷酸化的LC3顯著較野生型容易變性；若以ULD的變性曲線作為參考，LC3變性或去摺疊之過程的前期，可能部分發生在其NHD的α螺旋結構，而早於其ULD出現大規模的變性。

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利用散彈槍蛋白質體分析法尋找及鑑定與人類Lon蛋白酶結合之蛋白質:以Hsp60與mtHsp70為例

人類Lon蛋白酶是一種存在粒線體基質的ATP依賴型多功能蛋白質，參與分解遭氧化損壞的粒腺體蛋白質，重新摺疊損壞蛋白質的錯誤結構以及藉由結合粒線體DNA與粒線體DNA結合蛋白來調節粒線體DNA的基因表達。近年來許多研究指出，人類Lon蛋白酶不正常表現或缺失與許多人類疾病成因有關，如腫瘤生成、老化、糖尿病、腦神經細胞退化以及類中風發作症候群 (MELAS syndrome)。儘管我們知道人類Lon蛋白酶在粒線體生理功能調節中扮演重要角色，但它如何影響粒線體功能的分子機制尚待更進一步的研究。由於人類Lon蛋白酶被發現在癌症組織中過量表現，故在本論文中我們以過量表現人類Lon蛋白酶的細胞為對象利用蛋白質體的策略來探討與人類Lon有交互作用的蛋白質。 散彈槍蛋白質體分析法 (Shotgun proteomics) 是一種目前廣泛用於研究蛋白質與蛋白質間交互作用的研究方法。此方法主要是利用串聯式質譜 (Tandem mass spectrometry, MS/MS) 來決定某蛋白質經酵素分解後所得胜肽的序列。在我們的研究當中，我們設計了一套策略來連結免疫共沉澱法 (Co-immunoprecipitation) 及散彈槍蛋白質體分析法來研究與人類Lon蛋白酶有交互作用的蛋白質。過程中我們利用會穩定表現帶有Myc標記的人類Lon蛋白酶細胞–293M來進行散彈槍蛋白質體分析以及過程中我們利用特殊方法克服了必須使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 來去除蛋白質溶液中的介面活性劑和抗體蛋白質的限制，解決介面活性劑和抗體蛋白質出現在溶液中將會嚴重影響散彈槍蛋白質體分析法分析結果的問題。 藉由這個方法我們總共發現245個與人類Lon蛋白酶結合的蛋白質，包含參與粒線體伴護子系統 (Mitochondrial chaperone system) 的蛋白質、粒線體能量代謝的蛋白質以及目前已被發現會影響粒線體DNA穩定性的細胞骨架蛋白。為了驗證散彈槍蛋白質體分析法結果的可信度，我們利用西方墨點法 (Western blotting) 及免疫螢光染色 (Immunofluorescence) 做進一步的確認，並證明人類熱休克蛋白60 (Heat shock protein 60, Hsp60) 和粒線體人類熱休克蛋白70 (Mitochondrial heat shock protein 70, mtHsp70) 為人類Lon蛋白酶交互作用的蛋白質。進一步我們發現， 在人類細胞面臨氧化壓力下，過量表現的人類Lon蛋白酶可能藉由其chaperone 活性來影響Hsp60 和mtHsp70的穩定性並藉此作用抑制細胞凋亡 (Apoptosis) 發生。

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以蛋白質體及醣質體分析華勒蝮以及眼鏡王蛇兩種蛇毒的地理差異

在後基因體時代，蛇毒的研究在蛋白質體及轉錄體方面都快速進展，許多蝮蛇及眼鏡王蛇蛇毒亦不例外。探討蛇毒地理的或個別的變異性為蛇毒蛋白質體研究的一個層次或面向。在此，我們藉由蛋白質體以及醣質體分析方法探討來自兩個地區的華勒蝮以及四個地區的眼鏡王蛇其蛇毒當中主要的蛋白質的異同以及其生理功能特性。 第一部分 從蘇拉維西以及蘇門答臘的華勒蝮蛇毒中我們分別純化到兩個磷酯酶，其中一個是具活性、第六個胺基酸為榖胺酸的磷酯酶(稱之E6-PLA2)，而另一個則是不具活性、推測其第49個胺基酸可能為賴胺酸的磷酯酶(Lys49-like PLA2)。從這兩個地區分離純化到的磷酯酶無論是在分子量或是N端胺基酸序列都明顯不同，雖然他們在表現物種特有的神經毒素waglerin上具有高度保留性，從結果上看來這兩個地區的華勒蝮可能是兩個不同的種(T.subannulatus 以及 T. wagleri)。這個結果也是與西元2007年發表此蛇分類的結果是相符的。這兩個地區所表現具活性的磷酯酶，在本篇研究中也依照他們可能分屬的種名，命名為Tsu-E6(來自蘇拉維西)以及Twa-E6(來自蘇門答臘)。而後續研究發現，這兩個E6-PLA2在胺基酸序列第14位置的天門醯胺上有醣化的現象。進一步以N-醣醯胺酶(PNGase F)水解去除醣基可發現磷酯酶的分子量明顯從16 kDa減少到14 kDa，並且以質譜(MALDI-TOF)分析水解下來的醣基發現其是一個不具涎酸化(sialylation)且混合型式的寡糖。研究其生理功能，我們發現Tsu-E6對於由ADP引起的小鼠或人類血小板凝集作用都是抑制效果，而Twa-E6對於由ADP或膠原蛋白所引起的人類血小板凝集也是相同的作用，但對小鼠的血小板凝集卻是誘導作用。若進一步去分析這兩個磷酯酶在去除醣基後酵素活性或是血小板凝集作用則是沒有顯著差異。另外，探討醣基是否對蛋白質的熱穩定性有所影響，其結果發現Twa-E6的熱穩定性與其他不具醣基的磷酯酶是一樣的好。從以上結果可知，這個醣基的存在也許有其他的生理意義仍有 待我們進一步的探討。 第二部分 目前文獻上少有眼鏡王蛇毒地理差異的研究。我們買了分別來自印尼、馬來西亞、廣東、海南島等四個不同地區的眼鏡王蛇毒來分析其蛋白成分是否存在地理性差異。從蛇毒的酵素活性、用三種色層柱分析主要蛋白質組成，以及對小鼠毒性等分析結果發現其地理性的差異確實存在。以往文獻指出從中國幾個地區的眼鏡王蛇毒中純化到主要為已知名為OH-APLA2的磷酯酶，但來自印尼以及馬來西亞的蛇毒則表現另一在研究新發現並命名為PLA-3的酵素。三指毒素(3FTx)成分而言，雖然在這四個地區的蛇毒中具有或高或低的oh-55，但其他種神經毒素或3FTxs的組成卻是具有高度變異性的。另外，東南亞的眼鏡王蛇毒不像中國的含有明顯prothrombin活化酵素，我們的研究發現來自印尼的眼鏡王蛇毒含有比較高活性的鹼性磷酸酶(alkaline phosphomonoesterase)，卻有極低的磷酯酶。這些酵素可能彼此在蛇毒毒性上有協同作用，在未來可能值得進一步的探討。

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熱纖梭菌之纖維水解與半纖維水解雙功能酵素的蛋白質結構分析與工程改造

纖維素及半纖維素為生質能源的主要來源；降解這些長碳鏈多醣物質至單醣分子是需要透過纖維水解酶與半纖維水解酶共同協同作用。在本篇論文中所研究熱纖梭菌Clostridium thermocellum純化出來的雙功能水解酵素Cel5E可同時降解木質纖維素的主要組成纖維素及半纖維素中的聚木醣(xylan)。其纖維水解酶降解纖維素最適溫度及酸鹼值分別為50度和pH 5.0；而聚木醣水解酶降解聚木醣最適溫度及酸鹼值分別為60度和pH 6.0。 藉由薄膜層析法與酵素動力學實驗，顯示CtCel5E分解纖維素比分解聚木醣來的有效率，而鈣、鎂及鍶離子和還原劑DTT皆能增進CtCel5E的雙功能水解活性。第209號麩胺酸(Glu209)及第314號麩胺酸(Glu314)為雙功能水解酵素的催化位置。此外，藉由與纖維雙醣水解酶(β-1,4 glucosidase)的協同作用下，可完全將CtCel5E主要水解產物中的雙醣分子降解成葡萄糖，而這些單醣分子後續可被微生物發酵利用做生產生質酒精之用。據我所知，目前並無任何文獻指出為何5號家族的內切纖維水解酶同時也可辨認異聚木醣，為了找尋哪些胺基酸對於酵素受質專一性是重要的，藉由結晶學實驗，CtCel5E的酵素結構已被成功解出，且利用單定點突變實驗去找出哪些胺基酸對於酵素的水解能力是必要的。與TmCel5A酵素(PDB: 3MMU)的立體結構做比較後，觀察到CtCel5E第274號麩胺酸(Glu274)到第290號天門冬胺酸(Asp290)的位置具有段長度較短且易擺動的結構，且第270號酪胺酸(Tyr270)對於酵素催化過程中扮演重要的角色。再者，第128號精胺酸(Arg128)對於CtCel5E在pH 4.0酸性環境下降解纖維素的過程是重要的。 該酵素與受質共結晶的實驗仍在進行中，相信該實驗未來將會提供更完整關於酵素催化反應機制的資訊，也相信該實驗對於未來生質能源工業應用上有很大的助益。