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多胺類修飾在細胞凋亡過程中之角色

細胞凋亡是遍存於自然界的細胞自我死亡現象，許多作用與如何被調控的機制仍待證明。轉穀氨醯胺酶II、多胺類和多胺類修飾是否牽涉在細胞凋亡過程中，以及被多胺類所修飾受質的身分，一直都是許多文獻想研究的重點。 本研究中，我們使用實驗室製備的抗精胺抗體確定了在 staurosporine 所誘發 HeLa 細胞的細胞凋亡過程中，多胺類修飾是被轉穀氨醯胺酶II的轉醯胺功能和多胺類所調節；且隨著細胞凋亡的情況加劇，多胺類修飾更明顯。加入轉穀氨醯胺酶II的抑制劑：cystamine 後，轉醯胺反應會被抑制，多胺類修飾程度降低，細胞死亡率亦下降，因此判斷轉穀氨醯胺酶II的轉醯胺功能是能促進 HeLa 細胞凋亡。另外發現，細胞內多胺類的含量降低會使轉穀氨醯胺酶II的轉醯胺反應提高，加速細胞凋亡的發生，判斷多胺類具有保護 HeLa 細胞的角色。細胞凋亡過程中，被多胺類所主要修飾的兩個小分子蛋白質（分子量約為 14 kDa 和 20 kDa）的身分也是我們接續研究的重點。 本實驗室之前以蛋白質純化及質譜儀鑑定發現在小鼠組織中 HtrA2/Omi 蛋白質能與精胺結合，此蛋白質為促進細胞凋亡的重要蛋白質。本研究在 HeLa 細胞內確定了 HtrA2/Omi 蛋白質能被多胺類修飾，但被多胺類修飾的生理意義仍須進一步的探討與釐清。

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Atg1與Atg9在細胞自噬上之功能研究

「細胞自噬」是一種細胞降解物質的途徑，在維持細胞體內平衡和對於如飢餓，缺氧和氧化壓力環境下的細胞反應扮演不可或缺的角色。在這個過程中，細胞質會被一種雙層膜囊泡，稱為細胞自噬體所吞噬，隨後與溶酶體結合，降解所吞噬的大分子，循環再利用。自噬相關基因9（Atg9）是唯一在自噬相關蛋白中發現的膜蛋白，它會在高基式體，晚期內含體，以及細胞自噬體間循環移動，這種循環移動被認為是用來提供膜給正在形成的細胞自噬體。然而，Atg9的生理作用以及調控機制到現在仍然不是很清楚。 在本論文中，我們發現了一種分子馬達-肌凝蛋白-II，能夠調節Atg9的循環移動。我們發現在果蠅中Atg1激酶會經由直接磷酸化一種新的肌球蛋白輕鏈激-Sqa，導致肌凝蛋白-II的活化。在果蠅中，降低Sqa表現量或抑制Myosin-II作用，會抑制細胞自噬體的形成。同樣的，在哺乳類細胞中，我們發現Sqa同源基因-ZIPK和肌凝蛋白-II在自噬作用中也扮演了重要的角色。我們更進一步發現Atg1對肌凝蛋白-II活化的調控，會影響到Atg9的循環移動。因此，這些研究結果提供了證據顯示Atg1會經由活化肌凝蛋白-II控制Atg9的循環移動而調控細胞自噬體的形成，而此訊息調控機轉從果蠅到人類有高度的保留性。總結，我們研究的成果揭露了細胞自噬體如何形成之作用機制。

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Hsp90等蛋白參與細胞內磷酸鈣沈澱調控機制之研究

磷為生物有機分子的重要組成之一，生物體內舉凡結構性之細胞膜成分、生物能量供應之ATP及細胞遺傳物質之DNA、RNA等皆存在著磷酸分子；此外，磷酸溶液也是生物體內普遍存在的緩衝環境之一，生物體內大部分合成或代謝等酵素反應，皆需要在緩衝溶液中才得以完成。而鈣離子則是細胞內、外重要訊息傳遞分子之一，當生物體接受內、外部訊息時，鈣離子會由細胞外或細胞內儲存大量鈣離子的貯藏庫中被釋放至需要的地方，所以，細胞內會產生瞬間高濃度之鈣離子擾動，如此，局部大量的鈣離子必然會造成局部磷酸鈣沈澱的發生，然而，除了骨骼、牙齒等生物支持性構造需要藉由調控磷酸鈣沈積而形成結構性組織外，生物體細胞內若有不正常產生大量磷酸鈣沈澱，勢必對細胞造成傷害或誘導細胞的凋亡等反應。在細胞外，Fetuin-A 已被證實參與防止磷酸鈣沈澱發生重要調控因子之一，藉由Fetuin-A與磷酸鈣結合以防止磷酸鈣在細胞外的堆積。然而，在充滿著許多磷酸根溶液的細胞內，是否亦存在防止或抑制磷酸鈣沈澱產生的調節因子呢？ 在本研究中，我們利用蛋白純化、質譜鑑定、抗體免疫分析、細胞培養實驗及電子顯微鏡等方法證明：細胞內確實存在一些調節蛋白，這些蛋白分子包含有Hsp90, annexin A5, calreticulin, tubulin-β, nucleolin, PLC-β1, CAND-1及GAPDH等，這群調節蛋白我們稱為PMC (protein mineral complex)蛋白，在這群結合蛋白中Hsp90佔主要成分，為瞭解Hsp90與磷酸鈣調節機制，我們進一步從豬腦、原核生物E.coli.或真核細胞SiHa cell中純化或表現Hsp90蛋白，實驗結果發現：Hsp90可直接與amorphous calcium phosphate (ACP) 及hydroxyapatite (HA) 結合，其與磷酸鈣結合不需要其他輔助蛋白的幫忙；當Hsp90與磷酸鈣結合時，會產生多單元體蛋白組成的構形改變，此一Hsp90與磷酸鈣結合會被ATP、ADP、GTP、EDTA及雙磷酸鹽類藥物等所抑制，從免疫螢光細胞實驗中，我們亦發現其他如annexin A5, calreticulin, tubulin-β, nucleolin, PLC-β1, CAND-1及GAPDH等次主要PMC蛋白在細胞中與磷酸鈣結合部位與Hsp90相同。 我們進一步以鈣離子專一性通透劑(A23187, ionomycin)、鈣離子抑制劑(EDTA, EGTA)或骨質疏鬆症治療藥劑(雙磷酸鹽類藥物)等進行細胞試驗時，也證明細胞內這群PMC蛋白與磷酸鈣結合機制的功能存在，推測這些蛋白分子可能依其位於細胞中不同胞器內參與不同磷酸鈣沈澱調節功能；而雙磷酸鹽類之骨質疏鬆症治療藥劑對腸道所產生不適之副作用，也可由其細胞毒性試驗中得到推論證明。

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以磷酸化蛋白質體學技術探討乳癌幹細胞之特性

蛋白質磷酸化在真核細胞中是一個重要的調控機制，分析其動態變化可幫助了解磷酸化在生物體中的功能。儘管近年來將質譜技術應用於磷酸化蛋白質體的研究已有長足的進步，有效率的純化磷酸化胜肽仍是全面性分析磷酸化蛋白質體研究時不可或缺的步驟。基於磷酸根對三價鐵離子(Fe3+)以及4價鈦離子(Ti4+)具有不同程度的親和力和空間配位，我們在論文的第一部分新開發一互補式金屬離子親和層析法（IMAC）來增加磷酸化胜肽的鑑定數量。結果顯示藉由選擇有機酸結構以及濃度並添加有機溶劑能夠有效抑制非磷酸化胜肽之吸附，而且純化專一性可高達80%以上。透過分析最佳化的Fe3+-IMAC和Ti4+-IMAC方法從Raji B細胞樣品中所純化到的不同磷酸化胜肽，我們最大的發現是兩種方法所純化到的2905段磷酸化胜肽種類具有非常低的重複性(10%)。由於Fe3+-IMAC和Ti4+IMAC方法對偏酸性和偏鹼性磷酸化胜肽的親和力不同，並具有互補性的純化效果，可有效地的提高磷酸化蛋白的鑑定數量。此外這方法具有高重複性和低樣品損失率，我們認為此方法結合定量方法可應用於定量磷酸化蛋白質體的研究。 在開發出高效率的磷酸化胜肽純化方法後，我們想進一步在生物系統中驗證其應用性。因此我們利用此新開發的磷酸化胜肽純化方法結合無標記定量分析技術來研究醫學上的重要課題。人類乳癌幹細胞（BCSC）為一群具有新生腫瘤能力，起始細胞分化，並且對於放射治療和化療相對耐受性較高的細胞。在論文的第二部分，為從磷酸化蛋白質體的角度了解乳癌幹細胞獨特之性質，我們比較從同一乳癌組織(雌激素受體為陰性反應)中分出的乳癌幹細胞和非幹細胞之其他細胞的磷酸化蛋白質體差異。經由磷酸化蛋白質體之結果分析，我們得以描繪出可能參與細胞更新和能維護幹細胞特性的訊息傳遞路線，包括Notch，CDK/ Erk和JAK-STAT等訊息傳遞路線。透過生化及細胞實驗的驗證，我們證明了G protein-coupled estrogen receptor 1（GPER）於雌激素受體為陰性的乳癌患者中，在其過度表現或受其配體刺激時，會透過PKA造成BAD於Ser118位點上的磷酸化。透過使用RNAi來阻斷GPER的功能或進行BAD上Ser118位點突變，也同樣能夠降低乳癌幹細胞活性和乳腺球細胞的生成能力。這意味著GPER和其下游的PKA訊息傳遞路線為主要維持乳癌幹細胞特質的主角，而我們的研究結果顯示GPER具有高潛力成為新一代治療乳癌幹細胞之目標蛋白。

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建立蛋白質麩胱甘肽化特定位鑑定方法與結合質譜的免標定定量法策略

麩胱甘肽 (GSH) 藉由其上的硫醇與蛋白質半胱胺酸 (cysteine) 的硫醇形成雙硫鍵稱為蛋白質的麩胱甘肽化 (S-glutathionylation) 。 S-glutathionylation 是一種可逆的蛋白質轉譯後修飾反應，能夠調控細胞內氧化還原平衡與保護細胞避免過度氧化。雖然目前有許多的方法可以偵測蛋白質的S-glutathionylation，但大部份的方法中並無法直接地獲得特定修飾位置的資訊。在本實驗室之前的研究中提出了利用將大腸桿菌的 Gsp synthetase 與 biotinyl-spermine 送入人類細胞中，以鑑定細胞內含有 S-glutathionylation 的蛋白質及其修飾位置。這個方法提供了有效率且可大規模分析相關的蛋白質體學。在本論文中，我們應用並最佳化此以 Gsp-biotin 為基礎的親合性純化修飾蛋白質，另外結合質譜分析，達到專一性的辨識 GSH 修飾的位置，以及對被 S-glutathionylation 的蛋白質進行定量。 在本論文中，我們使用蛋白質酪胺酸磷酸水解酶1B (protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 作為模式蛋白，以探討在蛋白質和胜肽層級上胰蛋白酶水解以及純化 GSH 修飾的蛋白質/胜肽的效率，建立及最佳化整個純化以及樣品前處理的步驟。目前為止，利用質譜分析 GSH-PTP1B 的極限最低可達 62 ng 。我們也使用 MS1 細胞株，一個在探討氧化還原研究中被廣泛使用的細胞株，來探討所建立的純化 GSH 修飾蛋白質/胜肽步驟的效率。於細胞外的條件下對 MS-1 細胞蛋白質進行 GSH 的修飾並結合質譜分析，目前辨識到了472條含有 GSH 修飾的胜肽以及其所屬的317個蛋白質。於辨識到的蛋白質中，其中有一些已有文獻廣泛的探討它們的 S-glutathionylaiton 。此外，在本研究所開發的方法中，不但可以專一性的辨識胜肽鏈上被 GSH 修飾的位置，還可以分辨同一條胜肽鏈上具有多個 cysteine ，哪一個 cysteine 是被 GSH 所修飾。 在免標定定量法的部分，我們結合高敏感性的質譜分析以及生物資訊學的工具 (IDEAL-Q) ，藉由估計萃取的離子層析圖譜 (extracted ion chromatography, XIC) 訊號峰底下的面積以估算各 S-glutathionylation 胜肽的量。我們在 MS-1 細胞的蛋白質中加入一序列不同量的 GSH-PTP1B ，在 LC-MS/MS 分析之後計算其被 S-glutathionylation 的三條胜肽鏈 (包括 HEASDFPC32(GSH)R, GSLKC121(GSH)AQYWPQK, ESGSLSPEHGPVVVHC215(GSH)SAGIGR ) 訊號峰下的面積。並以面積對濃度作圖以得到標準曲線，獲得定量的範圍落在 1.8 pmol 到 3.9 nmol 之間。 最後，在結合此一整套純化以及質譜分析的流程以及定量的方法之後，可以進一步探討 S-nitrosylation 與 S-glutathionylation 的關係，以及 S-nitrosylation 的穩定性與反應性。本論文不但提供一個有用的方法鑑定 S-glutathionylation 的蛋白質體，並可以深入探討細胞內氧化還原的調控機制。

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探討氧化壓力下JNK途徑與細胞自噬系統之關係

細胞自噬作用是真核生物演化上高度保留的途徑。其對於反應飢餓、缺氧與氧化壓力並且維持細胞內之平衡扮演著重要的角色。已有研究指出活性氧化物可以誘導細胞自噬作用。在本研究中，發現細胞長時間暴露於過氧化氫下，可以藉由活化JNK活性誘發細胞自噬作用。更進一步的，在細胞自噬系統被抑制的情形下，JNK的活性會被延長。由此結果可見，細胞自噬系統可以負向回饋調控氧化壓力下所活化之JNK活性。此外我們發現降低其中一個atg基因的表現量會抑制過氧化氫所活化的JNK活性。我們進一步發現這個Atg蛋白會與JNK途徑中的一員相互作用。總結，我們的研究證實在氧化壓力的環境下，此Atg蛋白可能做為JNK途徑與細胞自噬系統之間的連接。

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果蠅選擇性細胞自噬作用模式系統的建立與探討

細胞自噬是透過分解細胞內成分短暫彌補營養缺乏時的調控機制。除了隨機分解細胞內物質，細胞自噬也可以選擇性地消除特定胞器來調控其數量和完整性。粒線體吞噬作用(mitophagy)首先在酵母菌中被發現。Mitophagy是一種只特定吞噬粒腺體的細胞自噬作用。Mitophagy截至目前研究被發現與神經退化性疾病有關，如帕金森氏症或阿茨海默氏症均被發現有mitophagy的缺陷。在此次的研究結果，我們藉由對果蠅幼蟲施以CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 或者粒線體complex I inhibitor rotenone兩種導致粒線體損傷的藥物來引發mitophagy。在添加CCCP或rotenone後，我們可以觀察到果蠅脂肪體(fat body)粒線體的損傷以及被吞噬的受損粒線體。此外，我們利用這個模型來檢驗先前經由我們實驗室發現的細胞自噬相關蛋白質Lack。當我們降低Lack表現量時可以抑制Atg1所導致的rough eye缺陷。而在果蠅的脂肪體中表達lack時，此蛋白亦能夠影響粒線體的形態以及吞噬粒線體的過程，但此機制仍須進一步研究與討論。

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TTP 家族蛋白在果蠅細胞與老鼠前脂肪細胞的標的RNA和功能分析

訊息核醣核酸 (mRNA)在細胞內受到嚴密調控。其中一種轉錄後調控是透過降解相關因子結合到位於mRNA三端未轉譯區 (3' untranslated region, 3'UTR)上的多腺嘌呤及尿嘧啶序列 (AU-rich element, ARE)來促進降解。TTP (tristetraprolin)家族蛋白可以透過鋅指區域 (tandem CCCH zinc finger)結合到ARE，造成mRNA易被降解。其在老鼠內有四個成員：分別是TTP，ZFP36L1，ZFP36L2和ZFP36L3；而在果蠅只有一個：DTIS11。為了探討TTP家族蛋白的功能作用，我們分別利用果蠅細胞及老鼠前脂肪細胞來研究。第一部分，發現TTP的新標的mRNA：eyes absent (eya)。利用核醣核酸交互作用沉降試驗 (RNA pull-down)以及螢光素酶報導基因分析 (luciferase reporter assay)，發現DTIS11會利用鋅指區域結合到eya mRNA並造成其降解。同時也發現表現DTIS11會降低細胞存活率。相同的結論我們也在人類乳癌細胞 (MCF7)得到: TTP可以使得eya homologue 2 (EYA2) mRNA降解並影響到細胞存活率，這可能是由於細胞凋亡。在第二部分的實驗，發現ZFP36L1和ZFP36L2對調節脂肪細胞分化可能扮演不同時期調控的角色。類似TTP的作用，ZFP36L1和ZFP36L2都可以結合到去磷酸酶Mkp-1 mRNA 3'UTR上並造成其去穩定性。利用慢病毒載體 (lentiviral vector)方式來抑制ZFP36L1或ZFP36L2表現，發現唯有抑制ZFP36L1會造成一些極早期基因 (immediate early genes)的核醣核酸表現量上升，其中包括Mkp-1 mRNA，同時並發現ERK活性降低以及抑制脂肪分化。於是我們提出TTP家族蛋白會在不同時期相互調控Mkp-1 mRNA進而影響到脂肪分化。綜合上述，本研究結果指出TTP家族蛋白會透過調控不同的標的訊息核醣核酸來影響到細胞的活性或是脂肪細胞的分化。