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鬆脆桿菌鳥苷二磷酸岩藻糖合成酶之結構分析

岩藻糖 (fucose) 常修飾在寡醣鏈末端，在許多生理作用上扮演不可或缺的重要性。鬆脆桿菌 (Bacteroides fragilis) 為人類腸道常見的共生菌之一；鬆脆桿菌會由宿主腸胃道表皮細胞上之末端取得岩藻糖，並利用岩藻糖生合成的補救途徑 (salvage pathway) 來合成GDP-L-fucose，以提高表面路易士抗原的表現量，達到躲避宿主的免疫作用。與其他物種不同，鬆脆桿菌將L-fucokinase (FK) 及GDP-L-fucose pyrophosphorylase (GFPP) 合而為一，而具有雙功能之蛋白 (稱為FKP)。本研究以酵素動力學和蛋白質結構來探討這個雙功能蛋白的結構與功能。根據蛋白質序列比對，我們將全長FKP (FL-FKP)、以及含有單一酵素功能的FK (518-949)、GFPP (1-496) 在大腸桿菌上表現、生產、純化後達到 > 95% 的純度，它們酵素動力學分析指出， FL-FKP所含FK活性與FK518-949比較起來，前者在Km (fucose)上比後者低10倍，在kcat (fucose) 和kcat (ATP) 的測量上，全長較單一活性區域高2倍。以GFPP活性作比較，FL-FKP和GFPP1-496兩者在kcat (fucose-1-P; f1p) 及kcat (GTP) 上，前者均較後者高出兩倍。此外，以分析型超高速離心法分析FL-FKP在緩衝溶液中的四級結構大多為三聚體。在x-ray結晶解析上，為了解決GFPP相位問題，我們將SUMO蛋白接至GFPP蛋白N端上並表現得到GFPP單體，並成功解析出它的結構 (解析度2.35 Å)，最後藉由GFPP、FK結構解析出FL-FKP 之結構 (解析度2.37 Å)。我們藉由結構、與其他相似蛋白結構比較及定點突變方式，發現FK活性區段催化是以D762為general base，作用在fucose C-1的羥基上；W599、D601及Q761負責與fucose的結合作用；R592、E751、S719及S720則與ATP的結合有關。這些資訊讓我們提出FK可能催化機制。除此之外，我們嘗試將兩個酵素活性之間的連結區域 (序列431-583) 作部分剔除，並無法表現可溶性之蛋白，發現這個區域提供活性與結構穩定的必要性。

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辨析細胞自噬作用時LC3B蛋白鍵結的PE種類

細胞自噬作用是真核生物內一種高度保留的自我吞噬機制,可以將細胞內 的大分子(例如:蛋白質堆積物)或胞器分解,用於循環再利用。在細胞自噬 作用的過程中,細胞質內會形成一種雙層膜的 autophagosome (自噬小體)並 將不需要的物質包覆在其內,當 autophagosome 與 lysosome (溶酶體)融合 後,autophagosome 中所包覆的物質就會被 lysosome 內的酵素給分解掉。在 autophagosome 形成的過程中,LC3/GABARAP(Atg8 蛋白在哺乳動物內的同 源蛋白)與 autophagosome 膜上的 PE (磷脂醯乙醇胺)產生鍵結的反應扮演 了重要角色,因為可以促進 phagophore(吞噬泡,為自噬小體的前趨物)膜的 延長。PE 的結構可分為三個部分,包含:甘油骨架.一或兩個脂醯鏈和一個磷 酸乙醇胺的頭部,不同的 PE 差別在於所接的脂醯鏈有所不同,且 PE 也會因為 所接的脂醯鏈不同而形成不同的形狀(柱狀或錐狀)。近來有研究指出, LC3/GABARAP 傾向於和高曲度膜上的 PE 形成鍵結,由於錐狀形 PE (PE 若 接有不飽和的脂醯鏈,形狀上像錐形)會使膜的排列不整齊而增加膜的曲度, 因此我們認為當細胞自噬作用發生時,LC3/GABARAP 會優先和 autophagosome 膜上的錐形 PE 形成鍵結。在本篇研究中,我們想找出當 HeLa cell(一種子宮頸癌細胞株)因飢餓而誘發細胞自噬作用時,其胞內的 LC3B 蛋 白會和哪些種類的 PE 形成鍵結。實驗過程中,首先我們將 HeLa cell 養在缺乏 養分的 EBSS 培養液中,且為了避免 LC3B-II 蛋白被分解掉,我們也在培養液 中加入了 lysosome 抑制物(E64d 和 pepstatin A)。接著我們透過免疫沈澱的方 式將細胞內的 LC3B-II 蛋白分離出來,並且利用重組的 Atg4B(一種已知的半 胱氨酸蛋白酶,可將 LC3B 和 PE 間的鍵結給切斷)進行切割反應。最後我們將溶液中的脂質萃取出來並加入 LiOH 去改變脂質的電性,再透過負離子模式 的電噴撒質譜進行偵測。從我們的實驗結果得知 PE 的脂肪酸鏈並不會影響到 其在電噴撒時的游離效率。此外,相較於營養充足的細胞,飢餓細胞內總體 PE 的種類及含量並不會有明顯的改變。如果未來我們能夠成功辨析出 LC3B 蛋白 鍵結的 PE 種類,我們就能夠更加了解脂質在 autophagosome 形成過程中所扮演 的角色為何。

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探討synapse defective 1 (SYDE1)功能缺失及胎兒發育遲緩的關聯性–SYDE1調控胎盤細胞移行與入侵

GCM1 (glial cells missing 1)調控胎盤滋養層細胞 (trophoblast cell)的分化與功能，是維持胎盤發育的重要轉錄因子之一。GCM1表現量下降與子癲前症的發生有所相關，顯示GCM1所調控的標的基因表現異常，可能導致妊娠併發症發病原因之一。在這篇研究當中，我們鑑定了一個新的GCM1標的基因-SYDE1，此基因包含了RhoGAP區域並且高度表現在人類胎盤組織，且我們證明了SYDE1會促進細胞骨架重構，細胞移行與入侵的能力。更重要的是，Syde1的基因剔除小鼠會伴隨著胎盤-卵黃囊屏障(placental-yolk sac barrier)，母體與滋養層細胞的交界面(maternal-trophoblast interface)，以及胎盤血管形成的構造不正常導致於胎兒發育遲緩與胎盤過小的現象。此外，藉由基因晶片分析Syde1基因剔除鼠的胎盤，發現腎素-血管收縮素系統(renin-angiotensin system)表現有所改變，而在懷孕過程中，在缺乏Syde1的胎盤中Syde1的同源基因-Syde2表現量有所上升，所以推測Syde2可能會補償Syde1的功能缺失。在透過shRNA抑制SYDE1表現的人類絨毛膜癌細胞株(JAR trophoblast cell)中同時表現SYDE2，觀察到正常功能的SYDE2會恢復細胞移行與入侵能力，而GAP區域功能缺失的SYDE2則無法彌補。更進一步在臨床研究上觀察發現，與相當妊娠週齡的控制組相比，SYDE1在早產與足月出生且胎兒發育過小的胎盤中表現量較低。綜合以上結果，我們證實了在胎盤發育過程中，GCM1透過調控SYDE1的表現而影響滋養層細胞的移行與入侵能力，而SYDE1表現過低與胎兒發育遲緩有所相關性。

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小鼠普立昂蛋白在不同狀態下之結構探討

腦海綿樣病變(Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE))亦稱為普立昂疾病，為一類具傳染性且致命的神經退化疾病，其主要發生原因主要為普立昂蛋白質之二級結構構型由α為主的結構轉變為β結構為主，並形成類澱粉纖維(amyloid)堆積造成腦部神經細胞死亡。然而，普立昂蛋白質之構型轉變確切的機制目前尚未被完全了解。目前普立昂蛋白結構之研究指出，N端區域之普立昂蛋白普遍認為不具有二級結構；C端區域則有三條α-helix以及兩條β-strand。目前已有研究指出，普立昂蛋白結構轉變機制，主要為普立昂蛋白在細胞膜上時，經由蛋白水解酶(protease)將N端區域水解後，剩餘之C端區域經由內吞作用之內噬體進出細胞內外，並由於內噬體內之pH值比細胞質之環境較低，造成C端區域之結構由α結構轉變為β結構，再經由內吞作用循環回到細胞膜上後，引起其他正常的普立昂蛋白結構轉變成異常的普立昂蛋白結構，便慢慢開始形成堆積(aggregation)。 在本實驗室先前之研究發現，將小鼠普立昂蛋白以胰蛋白酶進行水解反應後，第一個切位為胺基酸序列第105與106之間，因此本研究定義N端區域為胺基酸序列23-105；C端區域則是106-230。藉由利用分析式超高速離心以及圓二色光譜分析小鼠普立昂蛋白之物理特性，進而討論其結構變化。實驗結果發現，在pH4.2條件中，提高緩衝液中鹽類濃度，發現N端區域之構型開始改變，但是全長蛋白穩定度不變，因此推測N端區域與C端區域並無交互作用；而在pH5.2條件中，提高緩衝液之鹽類濃度後，發現全長小鼠普立昂蛋白之二級結構穩定性提高，因此推測可能為N端區域與C端區域產生交互作用使得其結構穩定性增加。

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Tristetraprolin磷酸化與結合蛋白之研究

Tristetraprolin (TTP)是一個核糖核酸(RNA)結合蛋白，可以調控含有多腺嘌呤尿嘧啶序列(AU-rich element)的核糖核酸的降解，且知TTP的功能受到結合蛋白的不同及本身蛋白磷酸化程度所調控。TTP會藉由CCR4-NOT脫腺苷化酶複合蛋白(CCR4-NOT deadenylase complex)進行核糖核酸的poly(A)降解。然而我們發現在CCR4-NOT腺苷化酶複合蛋白中的兩個腺苷化酶對於poly(A)降解是必要的。TTP的磷酸化除了已被廣泛研究的p38路徑外，ERK訊息傳遞路徑也可以去磷酸化TTP進而調控其穩定性、細胞內的位置和功能。先前利用質譜分析得知TTP的第316號絲氨酸會因ERK訊息傳遞路徑的活化而被磷酸化，且知第316號絲氨酸的磷酸化會降低TTP與CCR4-NOT腺苷化酶複合蛋白之間的結合。接著，我們進一步去研究TTP第316號絲氨酸磷酸化在生理條件下的功能及影響。在受到脂多醣(lipopolyssacharide,LPS)刺激的小鼠巨噬細胞RAW264.7中觀察到除了TTP的表現量增加外也伴隨著第316號絲氨酸被磷酸化，且此磷酸化降低了TTP和Cnot1蛋白的結合反而增加了和14-3-3的結合。另外，在脂肪前驅細胞3T3-L1的分化過程中利用MAPK去磷酸化酶(MKP-1)的抑制劑sanguinarine去促進ERK的活化和TTP第316號絲氨酸的磷酸化，進而抑制了3T3-L1脂肪前驅細胞的分化。此外同時也在NIH3T3胚胎纖維母细胞觀察到第316號絲氨酸的磷酸化使TTP較不容易進入細胞核。另外一方面，質譜分析發現和TTP結合的蛋白之一的組蛋白去乙酰酶(histone deacetylases3)是轉譯抑制分子，已知兩者皆參與負調控NF-κB訊息傳遞路徑的活化。我們發現TTP負調控NF-κB訊息傳遞路徑的可能因素，包含TTP會增加HDAC3的蛋白穩定性、TTP的磷酸化會使其較不易進細胞核還有TTP蛋白的不同區域對於轉譯調控有不同的影響。綜合以上研究結果，我們提供證據證明TTP的磷酸化和結合蛋白改變在基因調控上的分子機制。

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Rasd1在斑馬魚幼魚內之功能及表現調控

Neuropilins是Class III Semaphorins的穿膜受體蛋白，並且在軸突導向中扮演著重要的角色。Class III Semaphorins (Sema3s)通常參與在排斥性軸突導向，並且其機制已經有被許多研究報導過。然而，Sema3s也同時參與在吸引性軸突導向，其機制目前仍尚未明朗。Sema3D為一種Sema3s，並且表現在3到4天斑馬魚的腳間核(Interpeduncular nucleus)。同個時間點，Sema3D的受體Nrp1a表現在斑馬魚左韁核(Left habenula)。抑制Nrp1a表現將造成左韁核的軸突被導向腳間核的量減少，其肇因於缺少Nrp1a的軸突無法被Sema3D所吸引。過去的實驗室成員發現rasd1以及rab6bb兩個small GTPases與nrp1a共同表現在第4天斑馬魚左韁核內。各別以Morpholino knock down兩個small GTPases將造成與nrp1a 的Morphants相似的軸突導向缺失。我接收了rasd1突變種並且製造了rab6bb突變種，兩個突變種都是經由CRISPR/Cas9技術製造。我的分析資料顯示與野生種比較，rasd1突變種並沒有明顯的軸突導向缺失。此外，我發現Dexamethasone可引起特定組織表現rasd1，但韁核內生性rasd1表現並不受到Dexamethasone影響。除了rasd1突變種外，我使用CRISPR/Cas9製造了一隻在生殖細胞中帶有目標位置突變的rab6bb基因的斑馬魚。突變rab6bb基因的製造將可幫助我們了解蛋白質Rab6bb在細胞內中的的功能。

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TIFA蛋白在血管內皮細胞先天性免疫反應中之角色

類鐸受體所介導的NF-kappaB的激活是響應於助氧化和促炎性刺激的血管內皮細胞的一個主要的先天免疫反義。 我們確定了TIFA [TNFalpha receptor-associated factor（TRAF) interacting protein with a FHA damain]在血管內皮細胞中不但參與引發NLRP3炎症小體的誘導（信號1) 也參與了其活化（信號2)。我們首先發現氧化和炎性壓力如atheroprone流和高脂血症在in vitro及 in vivo實驗中皆能誘發與活化TIFA。接著，對於信號1的起動，固醇調節元件結合蛋白2（SREBP2)此一轉錄因子能上調TIFA的信使RNA表現，藉此誘導NF-kappaB和增強NLRP3炎症小體成員的轉錄。然而對於信號2的活化，我們實驗室發現Akt參與了TIFA Thr9的磷酸化，此磷酸畫的作用使TIFA-TIFA嗜同聚合體形成。 Thr9磷酸依賴性TIFA聚合體能夠促使NLRP3炎症小體的具合與活化，而此聚合作用是透過在活化的內皮細胞中TIFA和caspase-1之間的相互作用所達成的。另外， 當TIFA被過度表達時，我們發現我們發現細胞的自噬作用， 單核細胞的黏附作用，以及細胞焦亡反應皆細胞焦亡反應皆上升了。綜合以上結果，我們發現TIFA是透過誘導與加強NLRP3炎症小體活化之信號1和2的內皮先天免疫反應的關鍵介體。

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登革病毒感染經由甘露糖受體與凝集素CLEC5A形成多價異元複合體

登革熱是一種好發於全球熱帶與亞熱帶的重要病媒蚊傳染性疾病。登革病毒感染人類巨噬細胞時利用人類甘露糖受體與DC-SIGN作為用以穩定附著於巨噬細胞的主要受體，並利用凝集素CLEC5A作為次要附著受體，用以引發先天免疫系統的訊號傳遞以防禦病毒攻擊。但人類甘露糖受體與DC-SIGN這類主要附著受體如何與凝集素CLEC5A這類訊息受體交互作用與協同功能至今仍沒有被探討。本論文提出一個可能的模型，試著解釋具較強附著能力的受體如甘露糖受體與DC-SIGN與較弱附著能力的受體如CLEC5A，透過共同分布於一個夠小的範圍內以足以與登革熱病毒形成多價異元複合體，高附著能力的受體可以吸引登革病毒穩定在其上，而較弱附著能力的訊息受體可以因為分布在高附著能力受體的周邊提高與登革熱病毒的直接接觸的能力，提高引發先天免疫系統的觸發效率，並以此多價異元複合體賦予病毒附著與訊息傳遞間必要的邏輯連結，且提供抗病毒策略的新穎線索。

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膽固醇醣苷代謝物標定與分析以揭露它們如何增強胃幽門螺旋桿菌的致病性

世界上大約有一半的人口被胃幽門螺旋桿菌所感染，而這個細菌也是造成各種胃部疾病的主要原因。這種病菌是無法製造膽固醇的，它會吸收宿主細胞身上的膽固醇並將其轉換成各種膽固醇醣苷衍生物，包括膽固醇6'-酰基和6'-磷脂基葡萄糖苷（CAG 和CPG）。由於缺乏靈敏的分析方法，無法得知在CAG 和CPG 上面的酰基(acyl)或是磷脂基(phosphatidyl)的組成和變化，是否會影響在生理上所扮演的角色。在此，我們建立了一個達到飛莫爾(femto-molar)層級的代謝物標記法，並利用這樣的方式將這些衍生物做詳細的定性和定量的分析，得以建立膽固醇醣苷衍生物的質譜/質譜資料庫，並可分析所有的膽固醇代謝衍生物。進一步發現這些細菌能夠獲得宿主表皮細胞的磷脂，進行CAG 的合成。同時，我們也找到負責CAG 生合成的酵素(HP0499)，進一步證實HP0499 在感染宿主細胞時，會透過外膜小囊(OMV)或直接接觸的方式，將酵素及產物轉置到人類細胞上，以產生帶有較長或是較多不飽和酰基的CAG(又稱作含有人類脂質的CAG)，因而促進脂筏(lipid rafts)的形成，以及細胞表面的整合素α5β1 的聚集，導致增加細菌黏附到宿主表皮細胞，因而大幅增加毒素蛋白因子(CagA)轉置進入宿主細胞。這樣的結果支持了一個想法: 幽門螺桿菌演化出特殊的宿主/病原體的交互作用以增加細菌的毒性。我們的研究也詳細闡述了，不同酰基組成的CAG，如何連結到細菌的致病性。

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孔洞石墨碳管柱液相層析串連式質譜分析技術之研發與其在分離與結構鑑定神經膠質母細胞瘤之醣脂體醣鏈之應用

Mass-spectrometry (MS)-based glycomics aims to map all the molecular glycan species under specific physiological or pathological conditions. Glycosphingolipids (GSLs) are found to be involved in many biological processes. Overexpression of GSLs in different cancers has been observed widely, including in glioblastoma multiforme (GBM). The conventional MS method used for GSLs detection is mostly MALDI. However, the poor capacity for separation of isomeric molecules of MALDI is not sufficient for desired complete glycomic mapping. In this thesis, we developed a porous graphitized carbon (PGC)-LC-MS based workflow to systematically analyze all glycans released from GSLs in cells. By using acidic solvent system in positive mode, six GM1 (Hex3HexNAc1NeuAc1) standards were mixed together and then loaded onto PGC-LC-MS for separation. Under optimized gradient condition, the six standards were completely separated and their structures were also confirmed by CID-MS/MS. After platform being established, GSLs glycans of DBTRG GBM cells were applied to this platform for the isomer separation. The GM1 isomers (Hex3HexNAc1NeuAc) of DBTRG cells were separated, identified and quantified for the first time. Moreover, the whole GSLs of DBTRG cells could be separated and analyzed on the PGC-LC-MS system. Minor species, such as globo-series molecules, were also detected and several other isomeric glycans were identified. Next, this method was used to compare the changed expression of GSLs between DBTRG parental cells and stem-like neurospheres. The increased level of sialylated and decreased level of neutral GSLs were detected in neurospheres. Finally, the platform was further applied to profile and compare the intact GSLs of other GBM cells. The short GSLs usually have fewer isomers because of the simple molecular structures. On the other side, long GSLs usually have more isomeric ions because of their complicated structures. There are some unusual isomeric glycans being detected, such as Gb5/iGb5 distribution in each kind of cells examined. In short, we here developed a useful PGC-LC-MS platform for isomeric GSLs separation by LC and identification by MS/MS and it can be applied to more biological samples in the future.