臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
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本研究是以飼料酵母菌Candida utilis BCRC 21645作為表現外源蛋白質重組吳郭魚類胰島素生長因子之宿主，載體pGAPZB屬於Pichia pastoris表現系統，目前商業上並無法取得屬於C. utilis表現系統之載體，P. pastoris與C. utilis之菌種親源性較為接近，因此將IGF2基因插入載體pGAPZB中，命名為pGAPZB-IGF2，作為本研究之表現質體。 由前人所構築之C. utilis轉形株無法正常表現吳郭魚重組蛋白質IGF2，經由PCR檢測，發現其structure gene部分即IGF2基因仍正常存在於染色體上，但在GAP promoter的前半段序列可能發生遺失或是序列變異，因此重新構築菌種。 重新構築之C. utilis轉形株，其表現載體pGAPZB-IGF2雖然正確嵌入異源宿主C. utilis之染色體，但是轉形效率明顯相較於已知研究為低，目前轉形菌株中並不能有效率的篩選出表現外源蛋白質IGF2的菌種，結論是利用異源的載體來構築表現菌種，由於該載體上不帶有同源的啟動子或是其他相同的序列，造成轉形效率偏低，同時無法有效的表現目標的外源蛋白質，並不是一個理想的表現系統；未來即使經過長時間的篩選，可能篩選到表現量較理想之轉形株，但是其嵌入基因之穩定性不佳，將不利於研究之持續進行，故此表現質體之改良為未來研究之主要發展方向。
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植物細胞壁之主要成分纖維素，為自然界蘊藏最豐的碳源與多醣類，亦為最充裕的再生資源。由於纖維素結構緊密，其內含的醣類難以利用，須以化學或生化反應的方式將其水解，以提高纖維素於生物能源再利用率，而纖維分解酵素扮演了極重要的角色。 纖維分解酵素為一群水解酵素的總稱，可經協同(synergic)作用將纖維素分解，目前已知具有纖維素分解能力的生物包括細菌、真菌、原生動物等。其用途相當廣泛，已應用於眾多產業上，主要為食品與釀酒、動物飼料、紡織與衣物清洗、造紙工業及農業，其他用途包括：廢棄物處理、製藥工業、基因工程及污染防治等。目前已有多種同源(homologous)或異源(heterologous)表達系統，如細菌、酵母菌及絲狀真菌等，可生產出具功能性之纖維分解酵素。 本研究以巨型桿菌(Bacillus megaterium)表達Piromyces rhizinflatus之內切型纖維分解酵素(endoglucanase, EglA)。以T7啟動子替代商品化選殖載體pWH1520之木糖啟動子，並導入巨型桿菌β-澱粉水解酵素之訊息胜肽，以期得到強力啟動子且具外泌能力之載體，更進一步比較不同表達質體表現纖維分解酵素EglA之效果。 目前已完成外泌性載體pWH1520-S、T7 RNA聚合殖載體pWH1520-T7R之建構，表現質體pWH1520-C，亦完成T7啟動子之釣取，待接入目標基因eglA後，即可進行纖維分解酵素之生產及比較不同表達系統之功效。可成功地於巨型桿菌B. megaterium WH1520-C中穩定表達纖維分解酵素EglA，其酵素活性達5 U/mL；亦可於B. megaterium WH1520-T7R中表達T7 RNA聚合酶。
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代謝症候群指血糖調節異常 (胰島素抗性)、高血脂、中心型肥胖、高血壓等至少三項同時存在者，未經適當控制則具有極高之風險轉為第二型糖尿病及動脈粥狀硬化。PPARs (Peroxisome proliferators activated receptors) 為核受器家族的一員，受 ligand 活化後可啟動下游基因的轉錄，主調控葡萄糖及脂質代謝、運輸及貯存相關基因之表現。本實驗室在過去的研究中顯示，山苦瓜 (Momordica charantia L.) 乙酸乙酯萃物中含有可活化 PPARα 與 PPARγ 之成分，可調控其下游基因之表現。本研究先以高脂飲食誘發 C57BL/6J 小鼠產生血糖、血脂代謝異常現象，探討餵食山苦瓜全果凍乾粉末或其乙酸乙酯萃物，對小鼠體內葡萄糖及脂質代謝與肝臟 PPARα 相關基因表現之影響。分別餵食 C57BL/6J 小鼠含5% 大豆油 (B) 或30% 奶油 (C) 之實驗飼料 16 週後，C 組血糖、胰島素及血清中三酸甘油酯 (TG) 濃度顯著較 B 組高。再將 C 組小鼠隨機分為五組，一組維持原飼料，兩組分別更換為含有5% 山苦瓜全果凍乾粉末 (BGP) 及0.25% 山苦瓜乙酸乙酯萃物 (EAE) 之高油脂飼料，另外以含有0.5% clofibrate (CF) 或 0.004% rosiglitazone (R) 之高油脂飼料作為正對照組。繼續飼養四週後，BGP 組之血糖顯著低於 C 組 (p < 0.05)。飼養九週後，相較於 C 組，BGP 組體內葡萄糖耐受性顯著佳 (p < 0.05)。飼養 11 週後犧牲， BGP 組之體重增加量、血脂質、肝脂質皆顯著低於對照組C組。而 EAE 組在血脂、肝脂之部分指標顯著低於對照組 C 組。改以餵食 Wistar 大鼠含 5% 大豆油 (B) 或 30% 奶油 (C) 之實驗飼料 3 週後，C 組大鼠體重顯著高於 B 組。再將 C 組大鼠隨機分為六組，一組維持原飼料，三組分別更換為含有5% 山苦瓜全果凍乾粉末 (BGP)、1% 山苦瓜乙酸乙酯萃物 (EAE) 或 3% 山苦瓜酒精萃物之高油脂飼料，另外以含有1% clofibrate (CF) 或 0.01% rosiglitazone (R) 之高油脂飼料作為正對照組。飼養四週後，C 組出現口服葡萄糖耐受性較差，但 BGP 組則否 (p < 0.05)。飼養五週後犧牲，結果顯示 BGP 組之腹脂重量顯著低於對照組C 組，且山苦瓜全果凍乾粉末及其乙酸乙酯、酒精萃物可預防因高脂飲食造成的高血糖、高血清胰島素等症狀。此外，攝取山苦瓜全果凍乾粉末或其乙酸乙酯萃物能顯著誘發 β-oxidation 之關鍵酵素 acyl-CoA oxidase mRNA 之表現。綜合上述結果可知，5% 山苦瓜全果凍乾物可改善高脂飲食誘導之體重增加、高血糖、高血脂及葡萄糖不耐現象，可開發為調節血糖與血脂之功能性食品。
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本論文的研究目主要利用動物與細胞模式探討膳食鐵量對鐵硫蛋白質生合成之影響與粒線體IscS蛋白質表現與鐵硫蛋白質生合成的關係。本研究成功地選殖到大鼠IscS cDNA序列與其抗體的製備。利用Western blot與Northern blot分析得知大鼠IscS的表現以肌肉與心臟最高而肝臟與大腦最少。大鼠IscS蛋白質分子量為47 kDa，主要分佈於粒線體中，但是沒有測到細胞質含有IscS蛋白質。缺鐵大鼠肌肉IscS蛋白質含量減少約53%，而其mRNA表現量不變，但是缺鐵大腦與肝臟的IscS蛋白質含量與正常大鼠沒有差異，由此可見膳食鐵量對肌肉IscS蛋白質的調控主要在後轉錄的層次，並且具有組織選別性之差異。 另外採用Wistar雄性離乳大鼠，分成對照、缺鐵對飼育（pair-fed）與缺鐵三組，並分別以35 mg Fe/kg diet正常或缺鐵飼料飼養1和2週。第一與第二週膳食缺鐵肌肉粒線體IscS蛋白質量減少，分別為對照與缺鐵對飼育組的45-50%。此外缺鐵大鼠肌肉c-aconitase，m-aconitase，NADH dehydrogenase與SDH的活性分別減少55-76%、約50%、26-32%與34-59%，而c-aconitase、m-aconitase、NADH dehydrognase之24 kDa Ip subunit、SDH之Fp與Ip subunits蛋白質量減少50%、58-64%、61-73% 與56-79%，但是這些蛋白質的mRNA量則不受缺鐵的影響。缺鐵時肌肉中IRP1與IRP2活性顯著高於正常大鼠分別為2.6-2.7與2.2-2.3倍。可見膳食鐵量對肌肉c-aconitase，m-aconitase，NADH dehydrogenase與SDH的調控在後轉錄的層次。缺鐵大鼠肌肉粒線體IscS蛋白質含量減少，造成鐵硫複合體生合成不足，因而導致鐵硫蛋白質活性下降。 利用Tet-Off系統控制PC-12轉殖細胞粒線體IscS的表現與IscS蛋白質過度表現細胞的篩選，IscS mRNA與蛋白質量分別增加為2-7倍與1.2-1.6倍。然而這些細胞株的m-aconitase活性傾向不一致的反應，兩株的m-aconitase活性減少而三株m-aconitase活性增加。所有IscS過度表現細胞株的c-aconitase活性不變。加鐵培養時導致粒線體IscS蛋白質含量與m-aconitase活性增加20%，但是c-aconitase活性不變。關於IscS與aconitase活性的關係尚需驗證。 綜合以上，本論文首次證實膳食缺鐵減少大鼠肌肉粒線體IscS蛋白質的表現主要在後轉錄的調控，同時肌肉IRP1與IRP2的活性會受到膳食鐵量的調控。
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台灣氣喘病患中有八成對塵蟎過敏，其中最主要的過敏原之一即是 Dermatophagoides pteronyssinus 2 (Dp2)。氣喘疾病之特徵為呼吸道慢性發炎、發炎性細胞聚集，導致氣管阻塞、肺呼吸阻力增加。利用口服給予過敏原以降低過敏原專一性之免疫反應，稱為“口服耐受性” (oral tolerance)。本研究以轉型酵母菌 (Pichia pastoris)生產 Dp2 重組蛋白 (recombinant Dp2, rDp2)，使用此蛋白致敏 BALB/c 小鼠及氣管內刺激建立氣喘模式，並進一步探討給予致敏小鼠口服不同劑量 Dp2，對呼吸道發炎反應、T細胞調節及腸道免疫反應之影響。實驗 (一) 以七週大之雌鼠連續管餵 7 天 rDp2，餵食劑量分別為 0 μg/day (Control 組)、100 μg/day (O1 組)、200 μg/day (O2組)、500 μg/day (O5組)。實驗 (二) 則加入更高劑量之 1000 μg/day (O10 組)和 2000 μg/day (O20 組)。口服實驗第 1、5、14、21 天以腹腔注射 rDp2 進行致敏，空白組為注射 PBS。致敏結束後一週採集血樣以分析 Dp2 特異性抗體。第28、30天進行氣管內注射 Dp2 誘發小鼠氣喘症狀後，進行呼吸阻力測定。犧牲時收取小鼠肺沖洗液、脾臟細胞、皮耶氏節 (Peyer’s patch) 淋巴細胞及小腸後段均質液，分別進行肺沖洗液細胞組成計數、初代細胞培養與腸道 IgA 抗體分析。結果顯示，餵食 500 μg 以上之劑量除了可顯著減緩致敏小鼠肺呼吸阻力，並且降低發炎性細胞聚集，肺沖洗液中有顯著下降之 IL-4、較高的 IL-10 分泌量。同時血清中 Dp2 特異性 IgE 和總 IgE 量顯著較餵食 buffer 之 Control 組低。小腸的總 IgA 含量於各組之間無顯著差異，但 O5組具有顯著較低之腸道 Dp2 特異性 IgA。在脾臟及皮耶氏節細胞激素分泌方面，餵食劑量 500 μg 以上皆有顯著較低之 IL-4 分泌，於 Th1 傾向之細胞激素：IL-2 和 IFN-γ 則無顯著差異。口服各劑量 rDp2 對非特異性刺激下脾臟增生無顯著影響，但在抗原 rDp2 刺激下，各組皆具有較低之脾臟增生能力。實驗 (三) 則以 500 μg rDp2 餵食七天後即進行犧牲，觀察在餵食過敏原短期內，是否即影響到全身性免疫系統，結果顯示：口服過敏原七天後即可顯著抑制脾臟細胞特異性增生反應，並且同時有顯著較低的 IL-2 及 IL-5 分泌量。綜合以上結果，短期口服較高劑量之過敏原 rDp2能誘發口服耐受性，可能藉由抑制 Th2 免疫反應、減少 IL-4 生成進而調節 B 細胞的同型轉換(class switch) 使 IgE 減少，並減緩過敏性呼吸道發炎之現象。
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本論文是以國內液蛋工廠生產之液蛋白為原料，以田口氏試驗設計法（L9），探討不同液蛋白固形物含量（3、4及5%）、液蛋白水解酵素反應溫度（45、50及55℃）、反應液之pH值（pH 5、7及9）及Flavourzyme 1000L蛋白質水解酵素劑量（4000、5000及6000 unit/g liquid egg white solid）對液蛋白之蛋白質水解度、水解液色澤及其加熱殺菌（75℃，30 min）後之性狀的影響。試驗結果顯示，當液蛋白水解時間為1小時之水解度範圍為9.21-18.68%，而水解時間增加至8 小時時，水解度則提高至12.27-32.29％，此表示水解度隨著反應時間的增加而提高，其中最高液蛋白水解度之反應條件為：液蛋白固形物含量為5%、反應溫度為55℃、反應液pH值為5及Flavourzyme劑量為6000 unit /g liquid egg white solid。液蛋白水解液經加熱殺菌後，依液蛋白水解度之高低與反應時作用之pH值，分別可得具流動性之澄清水解液、半流動性之軟膠體或不流動之膠體。以獲得最高液蛋白水解度為水解條件之繫帶水解液之水解度亦隨著反應時間的增加而提高。 利用HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography -Pulsed Amperometric Detection) 測定經酵素水解且管柱分離純化之液蛋白與繫帶樣品的唾液酸含量分別為0.031% (db) 及0.27% (db)。在血管收縮素轉換酶（angiotensin converting enzyme, ACE）抑制能力測定結果得知，欲得抑制ACE能力較佳的活性胜肽，其水解條件為：液蛋白固形物含量為4（水解1 hr）或5%（水解2 hr）、反應溫度為50℃、反應液pH值為5及Flavourzyme 1000L酵素劑量為4000 unit /g liquid egg white solid。此結果顯示，較高水解度的水解液未必具有較強之ACE抑制能力。在固定的水解條件（繫帶固形物含量：2.6％、反應溫度：55℃、反應液pH值：5、添加蛋白質水解酵素量：6000 unit /g chalazae solid）下，繫帶水解1、2、4和8小時得到的活性胜肽其ACE抑制能力則隨水解時間延長而有所提高。此外，以獲得最高ACEI％活性的水解條件之酵素水解過程並不會影響繫帶中唾液酸的含量。 進一步以獲得最高ACEI％活性胜肽的水解條件進行液蛋白水解，殺菌前的液蛋白水解液之IC50值為0.40 mg/mL，殺菌後液蛋白水解液的IC50值則為0.37mg/mL。若與其他不同來源及酵素水解方法之蛋白質水解液所測得之IC50 值（0.11~121.74 mg/mL）相比較，本研究所得之液蛋白及繫帶水解液具有良好的ACE 抑制活性。
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靈芝屬(Ganoderma spp.)是一種白腐型真菌，具有各種可分解木材的外泌酵素，包括纖維素水解酵素(cellulase)和半纖維素水解酵素(hemicellulase),、果膠質水解酵素(pectinase)、漆氧化酶(laccase)、木質素過氧化酶(lignin peroxidase)和錳過氧化酶(manganese peroxidase)。其中錳過氧化酶是一種含有血基質(heme)的酵素，在二價錳離子以及過氧化氫存在的環境中能將酚類多環物質氧化分解，白腐型真菌利用此酵素分解木質素結構使其菌絲能有效深入木質纖維中分解纖維素等多醣以獲得養分。本實驗以含有ABTS的培養皿測試十株靈芝屬菌株的胞外酵素，發現所測試靈芝屬真菌都有可分解ABTS(2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))的外泌酵素。並利用Genome Walking、五端RACE和PCR增幅技術自台灣靈芝(G. formosanum 0109, BZ)、新日本靈芝(G. neo-japonicum 0813, VZ)和南方靈芝(G. australe 0705)中選殖出六段新的錳過氧化酶基因序列。以RT-PCR增幅基因首尾端具有限制酶切位的台灣靈芝0109錳過氧化酶的cDNA，並將此基因轉殖入大腸桿菌(Escherichia coli)以及嗜甲醇畢赤氏酵母(Pichia methanolica)進行異源表達，得到在C端接有六個組胺酸(histidine)的錳過氧化酶以利後續純化的重組蛋白。
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Proteasome是真核細胞中重要的蛋白質水解系統，它可以降解被ubiquitin標定的蛋白質，藉以維持細胞的正常功能。澱粉磷解脢 (L-SP) 在其胺基酸序列上，具有PEST region及destruction box等訊號序列，顯示容易遭受降解；而研究也發現L-SP的確容易降解，並可能與其活性調節有關 (Chen et al., 2002)。張世宗 (1999) 在純化L-SP的過程中，發現一高分子量L-SP活性色帶HX，並推測HX可能是L-SP和proteasome的結合體。陳安娜 (2001) 續以親和層析管柱的專一性吸附能力，證明L-SP與proteasome可能相互結合。林怡岑 (2003) 以雙向免疫擴散，證實HX確是L-SP與proteasome的結合體。本論文接續上述研究，在HX的純化樣本中發現L-SP與proteasome的活性區重疊；HX以原態膠體電泳之免疫呈色結果發現，J3b抗體無法與L-SP結合，此種遮蔽現象卻可在SDS-PAGE之免疫呈色中解除，顯示proteasome可能結合在L-SP的N-端。利用Blue native PAGE加上LC-MS/MS的身分鑑定，確定HX為L-SP與proteasome的蛋白質複合體。已知目標蛋白質的降解，可透過磷酸化修飾與proteasome結合，但實驗顯示成熟甘藷塊根中，所含磷酸化L-SP極少，其詳細機制有待進一步探討。
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蔗糖合成酶催化蔗糖與 UDP 轉換為果糖及 UDPG 之可逆反應。在水稻中有三種 RSus 基因 (RSus1, RSus2, Rus3)，RSus1 以及RSus2 在水稻中各組織中皆有表現，而 RSus3 則主要表現於水稻種子中。本論文由 Pichia pastoris 表現之 RSuS2，探討其酵素功能。 將 RSus2 cDNA 送入酵母菌 P. pastoris 中表現，轉形株以甲醇誘導 60 小時後，可以得到最大的 RSuS2 蛋白質量以及 SuS 活性。將重組 RSuS2 進行純化並進行生化性質分析。重組 RSuS2 對於蔗糖、UDP、果糖及UDPG之 Km 值分別為 104.8 mM、0.099 mM、6.65 mM 及 0.146 mM。Ca2+ 以及 Mg2+ 會促進合成方向的活性。代謝中間產物 fructose 6-phosphate 會抑制分解方向的活性，而 fructose 2,6 bisphosphate 則會活化分解方向的活性。此外，重組 RSuS2 具有膜結合型式的蛋白質存在，並且純化後的重組 RSuS2 分解方向活性可以被界面活性劑 Triton X-100 活化，合成方向的活性則可以被磷脂質 (phospholipid) 活化。
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肥胖引起之胰島素抗性是造成代謝性症候群的主要因子，而adipokines在胰島素抗性扮演重要的角色。Leptin具『抗肥胖荷爾蒙』的角色，參與能量恆定調節，本論文欲探討，攝取高油飲食，餐後之TRL（triacyglycerol-rich lipoproteins）是否影響ob基因表現。由於發炎反應和氧化壓力參與胰島素抗性發生，故探討發 炎誘發劑LPS和氧化壓力來源H2O2對具有抗胰島素特性之resistin的影響及其可能調節機制。 在TRL 對ob 基因影響的實驗中，因為長期攝取高油飲食易造成肥胖，攝食高油飲食後，血液中會出現高濃度的TG（triacylglycerol），TG 主要利用TRL運送至周邊組織，所以探討高油飲食後之TRL 是否影響ob 基因表現。雄性Wistar大鼠經過禁食48 小時後，分別給予高油飼料或無油高醣飼料，復食30 分鐘移走 飼料，分別在復食後第2、4 和8 小時犧牲。結果，高油組大鼠的血漿TG 濃度顯著較高（p < 0.05），血漿中leptin 濃度和脂肪組織之ob mRNA 表現顯著低於無油高醣組（p < 0.05）；兩組之血漿葡萄糖和胰島素濃度沒有顯著差異。高油組血漿TRL 濃度顯著高於無油高醣組，推測TRL 可能參與調節ob mRNA 表現。收集大鼠管餵5mL 大豆油3 小時後之血漿TRL，處理已分化之3T3-L1 脂肪細胞，結果顯示，TRL 顯著抑制3T3-L1 脂肪細胞之ob mRNA 表現，呈現劑量和時間效應，並且可抑制胰島素所提高之ob mRNA 表現。從結果得知，高油飲食餐後有較低ob mRNA 表現和血漿leptin 濃度，可能是因為TRL 抑制ob 基因表現所致。 在囓齒科動物，resistin主要在脂肪組織表現，且參與胰島素抗性之作用。人類resistin mRNA在單核球細胞表現最高，推測resistin在發炎反應和氧化壓力引起之胰島素抗拒扮演重要的角色。於是利用LPS誘發發炎反應，以及H2O2當氧化壓力來源，探討單核球細胞和巨噬細胞在模擬生物體之發炎反應和氧化壓力環境下，其resistin mRNA表現之變化，並探討其可能之調節機制。在LPS引起發炎反 應之實驗，LPS顯著提高RAW264.7 巨噬細胞和小鼠肝臟巨噬細胞resistin mRNA表現。抗發炎試劑dexametasone、genistein和PPARγ 之agonists（ciglitazone、pioglitazone和15d-PGJ2），顯著地抑制經由LPS刺激提高resistin mRNA的作用。從actinomycin D降低LPS刺激所提高之resistin RNA表現量，可知LPS在轉錄層次調控resistin RNA表現。PI3K、ERK1/2 和NF-κB之各別抑制劑Ly293002（25 nM）、U0126（2.5 μM）和CAPE（10 μg/mL）阻斷LPS對resistin mRNA的活化，且免疫螢光染色分析可見NF-κB之p50 subunit大量轉位至細胞核。綜合以上結果，PI3K、ERK和NF-κB參與LPS對巨噬細胞之resistin mRNA的活化作用。 當以H2O2處理，THP-1 和人類PBMC（peripheral blood mononuclear cells）resistin mRNA的表現量明顯增加。由actinomycin D抑制H2O2對resistin mRNA的活化，可知H2O2經由轉錄層次驅動resistin mRNA表現。在THP-1 細胞，NF-κB之抑制劑CAPE（10 μg/mL）顯著地降低H2O2所增加之resistin mRNA含量，且p50 subunit因H2O2處理而大量轉位至細胞核，得知NF-κB參與H2O2以促進resistin mRNA表現。此外，H2O2並不影響TNF-α之表現，因此H2O2提高resistin mRNA表現之機制，有別於LPS的活化作用。