臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
國立臺灣大學,正常發行
選擇卷期
已選擇0筆
- 學位論文
我們在阿拉伯芥中發現四個豬的MAPR (putative membrane-associated progesterone receptor component 1) 同源蛋白質，分別為AtMAPR2、AtMAPR3、AtMAPR4 以及AtMAPR5。在先前的研究中指出，位於細胞膜上之AtMAPR5 (putative membrane steroid binding protein, MSBP1) 可在胞外與黃體素及芸苔素內酯結合，且黑暗培養可抑制在下胚軸中該基因之表現，受到光照則可回復表現，推測在阿拉伯芥中功能為細胞延長之負調控因子。AtMAPRs家族蛋白質中其他三者的功能則尚未明瞭，因此嘗試以細胞、組織定位及觀察過量表現AtMAPRs基因轉殖株之性狀，探討AtMAPRs可能之生理意義。在本論文中利用基因槍將AtMAPR2與GFP之融合基因轉殖於洋蔥表皮細胞，由GFP螢光位置以得到AtMAPR2在細胞中之定位，結果發現AtMAPR2雖然有較為聚集在細胞核內之情形，但也散佈於細胞質中；而使用GUS報導基因的暫時性表現結果也間接說明AtMAPR2並非核蛋白。另一方面，利用農桿菌轉殖法得到過量表現AtMAPR2-GUS-GFP之阿拉伯芥T2轉殖株，使用共軛焦顯微鏡觀察其幼苗之根部及下胚軸的螢光表現，發現AtMAPR2會聚集在細胞中的某種胞器內且並非細胞核。而藉由GUS染色發現，經過不同光照處理培養之T2轉殖株中，AtMAPR2在下胚軸處也許可藉由全日光照而增加其蛋白質之穩定性，且可能在植株發育的前四天即決定AtMAPR2之穩定性，之後便無法以光照或黑暗對其穩定與否產生影響。至於藉由不同賀爾蒙處理下，過量表現AtMAPR2轉殖株根部的發育，推測其直接或間接參與了由auxin所調控之根部延長。這些結果不但有助於釐清AtMAPRs家族之可能生理意義，未來更可將過量表現AtMAPR2之轉殖株與RNAi或T-DNA突變株進行雜交，以期能藉由觀測性狀改變而確定其可能之參與之訊息傳遞路徑。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
研究目的: 動物實驗與流行病學研究顯示，鎂攝取量不足可能會影響胰島素作用 以及第二型糖尿病的發生，本研究的目的首先在於釐清鎂攝取量、血漿鎂濃度以及尿液鎂排出量三項指標之間的相關性。其次則是以前瞻性研究法分析鎂營養狀況或不同的營養素攝取型態與後來發生第二型糖尿病的危險性，以期了解到底是鎂，還是與鎂相關之飲食成份，組合式的降低疾病風險。 材料與方法: 本研究使用「竹東及朴子地區心臟血管疾病長期追蹤研究」五次循環所收集的資料進行分析，首先以第一循環的3897人與第二循環的4836人分析鎂營養狀況的飲食、血液、尿液指標值，觀察性別、年齡別差異、三指標之間的相關性以及兩項生化指標與腎功能的相關性。在前瞻性分析中，以第二循環為基線，選取30歲以上、不曾罹患糖尿病、心血管疾病、中風或癌症的個案共1334人的資料，使用Cox’s model調整多變數，估計鎂營養狀況或其他營養素攝取不同時，發生糖尿病的相對危險性。最後則是使用因素分析，將飲食頻率問卷估計出的19種營養素攝取量減少為數個因子，分析營養素攝取型態與糖尿病之間的關係。 研究結果: 飲食鎂攝取量與尿液鎂/肌酸酐比值有顯著但低度的正相關(r = 0.076, p=0.0008)。而血漿鎂濃度與尿液鎂/肌酸酐比值分別和血漿肌酸酐濃度呈現顯著正相關與逆相關，推測這兩項生化指標有可能部份反映腎功能。而經過調整年齡、性別、肥胖、抽煙飲酒習慣、運動習慣、家族糖尿病史、高血壓、高血糖與血脂異常等因子之後，鎂攝取量四分位組中較低的三組發生糖尿病的危險性都顯著高於最高組。而尿液鎂/肌酸酐比值與發生胰島素阻抗危險性也呈現顯著但幅度略低的逆相關。根據各種營養素攝取量經過因素分析找出四個因素，因素一剛好包含鎂、膳食纖維及鉀攝取量，因素三包含膳食纖維和鉀，兩者均與發生糖尿病危險性呈顯著逆相關。而膳食纖維、鉀攝取量單獨與糖尿病危險性呈現顯著逆相關，且膳食纖維的相關幅度超越鉀以及因素一、因素三。 結論: 本研究結果顯示鎂營養狀況不良可能低度顯著的增加胰島素抗性，但不影響糖尿病發生率；而多攝食富含鎂、膳食纖維和鉀的食物，特別是富含膳食纖維的食物，才能降低發生糖尿病的風險。不過到底是膳食纖維還是其他食物成分或各種有益成份之組合所呈現之效果，還有待進一步之探討。
- 學位論文
中文摘要 登革熱病毒（Dengue virus）可藉由病媒蚊感染人體而導致登革熱或者嚴重的出血性登革熱及登革熱休克症候群，致死率可達15%，目前為止尚無有效的藥物或者疫苗可供預防使用，如何早期篩檢就顯得相當重要。鼠疫桿菌（Yersinia pestis）為鼠疫 ( plague ) 之致病原，站在公共衛生預防的角度上，實有必要建立一套快速且有效的檢測方法。壓電石英晶體免疫感測器之檢測原理在於分析物藉由抗體吸附到石英晶體表面上會產生振盪頻率的變化。本論文主要研究壓電石英晶體免疫感測器 ( Quartz crystal immunosensor )應用於快速檢測登革熱病毒與鼠疫桿菌，利用自組裝單層膜技術 ( Self-assembled monolayer, SAM ) 將其對應之單株抗體固定於晶片表面上用來檢測樣品中存在之登革熱病毒NS1蛋白質或鼠疫桿菌F1蛋白質，固定法中以11- Mercaptoundecanoic acid法有較佳之固定效率。應用本研究室陳建源教授發明之自動吸取裝置檢測樣品，可於五分鐘內完成檢測。樣品中NS1與F1蛋白質兩者檢測結果於濃度0.1∼20μg /ml具有良好線性關係，R2 分別為0.9944與0.9889，系統檢測極限可達0.1μg /mL。將樣品以同濃度等體積和人體血清HSA混合檢測，檢測結果於0.1∼20μg/mL具有良好線性關係，陽性反應為干擾值五倍，顯示檢測結果具專一性。檢測結果之相對標準差均在20%以內。另外模擬樣品於人體血清中檢測，必須在稀釋倍數103以上才能有較佳之檢測效果，檢測極限可達0.1μg /mL。本研究綜合氣相與液相檢測之優點，應用自動吸取裝置成功縮短檢測時間且操作步驟簡易，藉此期望能構築具高靈敏度、低成本、可用於快速檢測之免疫型壓電石英晶體生物感測器。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
摘要 前言 血液中的同半胱胺酸，是目前一個備受爭議的心血管疾病危險因子，而參與同半胱胺酸代謝的營養素葉酸、維生素B-6與B-12，被認為可以經由降低同半胱胺酸濃度，達到減少心血管疾病發生的風險。然而，目前的研究結果，仍無法定義葉酸、維生素B-6與B-12在缺血型中風發生中所扮演的角色，且其與缺血型中風的關連，是否真的是經由調控同半胱胺酸濃度達成。本研究以前瞻性的研究法，探討飲食與血漿中葉酸、維生素B-6及B-12的狀況，是否對缺血型中風發生危險，具有顯著的影響力；此外，其關連性是否與血漿同半胱胺酸有關，也是本研究探討的重點。 對象與方法 以竹東朴子地區心臟血管疾病長期追蹤研究之受試者為對象，選擇在基線40歲以上沒有重大疾病的中老年人進入研究。1991-1993年間收集受試者的基本資料與飲食頻率問卷。利用世代研究方式，進行血漿葉酸、維生素B-12 (N＝2126)及飲食中葉酸、B-6、B-12的攝取量 (N=1779)與缺血型中風關連性探討。血漿維生素B-6與缺血型中風的關連性則利用重疊式病例對照研究(N=416)，以病例組對控制組1:2的形式，進行探討。此外，利用因素分析評估21種營養素之攝取量，探討飲食型態與缺血型中風間的關連性。 結果 飲食與血漿中的葉酸、維生素B-6及B-12與同半胱胺酸的濃度具有顯著的負相關性存在。血漿中的葉酸或B-12的濃度較低，並不會造成缺血型中風的危險性增加，但較低的血漿維生素B-6，對於缺血型中風的發生危險有顯著的提升(HR=1.58; 95%CI: 1.09-2.31）。然而，當血漿中葉酸、B-6與B-12濃度皆低時，缺血型中風的危險性大幅度增加，且在校正血漿同半胱胺酸後，達到顯著差異(HR=3.20; 95%CI:1.17-8.78)。飲食葉酸的攝取量降低，會造成缺血型中風發生的危險性增加(HR=2.44; 95%CI:1.33-4.51)，但B-6與B-12的攝取量則沒有顯著關連性。而在因素分析結果中，植物性營養素因子及營養素：鎂、鉀、膳食纖維，同樣也可看到與缺血型中風發生危險間的顯著線性趨勢。其中，以植物性營養素因子對於缺血型中風的保護性最強。 結論 由竹東朴子地區心臟血管疾病長期追蹤研究結果顯示，血漿中多重營養素瀕臨缺乏對於缺血型中風的發生危險性方呈現顯著之預測性，此效應獨立於同半胱胺酸。此外，植物性營養素因子較之單一營養素對缺血型中風發生有較高之預測性，顯示多重飲食營養因子攝取量之共同效應，是極其重要的。
- 學位論文
先前研究顯示，在甘藷 β-澱粉酶的催化機制中，參與基質結合區中的許多胺基酸可能協助催化反應。因此，張 (2003) 分別將與第一個糖及第四個糖作用的相關胺基酸進行點突變，這些突變株分別喪失不同程度的活性。在不同 pH 值的酵素動力學結果分析，發現與第一個糖作用的胺基酸中，His 94 對於催化作用扮演最重要的角色；而在與第四個糖作用的胺基酸中，疏水性的胺基酸對於整體催化作用影響較大。 先前研究已知 β-澱粉酶為澱粉磷解酶的非競爭型抑制劑。將帶有不同程度活性之 β-澱粉酶突變株與澱粉磷解酶進行反應，發現澱粉磷解酶的活性受到抑制，但是抑制的程度並不與 β-澱粉酶本身的活性成正比。另一方面，β-澱粉酶的活性可能透過澱粉磷解酶的作用而被調節，並且利用薄膜色層分析法發現在澱粉磷解酶的存在下，β-澱粉酶會失去其多重攻擊的特性。不同pH 值環境下的酵素動力學分析顯示，在澱粉磷解酶的存在下，β-澱粉酶的活性在較低pH值環境下 (pH 4 以下) 下有上升的趨勢;但在較高的pH值環境下 (pH 4 以上)，β-澱粉酶的活性則迅速的降低。近來研究中顯示夜晚時，阿拉伯芥葉中 β-澱粉酶為負責澱粉降解過程中的重要酵素。因此，我們推測 β-澱粉酶的活性可能透過澱粉磷解酶的作用來進行調節。 V
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
缺鐵為我國的營養問題之一，可藉由提升鐵生物利用率來改善。本實驗目的在於利用Caco-2細胞模式，探討維生素 C促進鐵吸收之新作用機制，並評估新型鐵劑及食品對鐵生物利用率的影響，作為應用於人體之參考。Caco-2細胞在滿盤後13天進行攝鐵實驗，其條件為apical site 添加100μM Fe處理6小時，測量細胞內鐵蛋白作為攝鐵能力之指標。 探討維生素 C作用機制時，Caco-2細胞培養於雙層培養皿，控制組為apical site 提供鐵源，實驗組則分別在apical site或basolateral site添加維生素C。控制組Ferric reductase 活性為13 ± 1 μM Fe2+/hr.well，鐵蛋白含量為69 ± 8 ng/mg protein。結果顯示，當維生素C添加在apical site時，ferric reductase 活性及鐵蛋白含量增加分別為控制組的7-8及5倍，反之，當維生素C 添加在basolateral 時則分別為控制組的3-4及4倍，在此証實維生素C除了在apical site和鐵進行化學性還原反應外，還有參與細胞內還原三價鐵能力來促進鐵吸收。 Caco-2細胞評估不同食品的鐵生物利用率中，發現Ferrous bis-glycine (FBG) 在碳酸飲料中鐵生物利用率和FeSO4相似Relative biological value (RBV) 139，但在四物萃取液中FBG鐵生物利用率高於FeSO4 (RBV 192)；蜆精對細胞鐵蛋白合成量無影響，但雞精則會抑制，FBG 在雞精中可發揮其高鐵生物利用率的優勢 (RBV 209)；果寡糖對 FeSO4、FBG、FeCl3 (RBV 95-102) 的鐵生物利用率不會造成影響。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
靈芝自古便是中國傳統醫學中的珍貴藥材，被認為具有滋補強身、扶正固本之效。近代科學研究也證實靈芝萃取物具有抗腫瘤與增強免疫力之功能，然而多數研究認為靈芝主要活性成分為多醣體及三萜類化合物，直至 1989 年 Kino 等人自靈芝（Ganoderma lucidum）菌絲體純化出具有免疫調節功能之小分子蛋白質 LZ-8，確立另一種活性物質免疫調節蛋白之存在。 本研究針對十種靈芝屬菌株進行聚合酶連鎖反應分析，發現靈芝免疫調節蛋白 LZ-8 相似基因普遍存在於靈芝屬菌株，然而這些菌株所得之基因序列並非皆與lz-8相同，部分菌株更發現同時具有兩種以上的 LZ-8 相似基因。此外採用 genome walking 技術於 G. microsporum 及 G. fornicatum 分別選殖出三條靈芝屬免疫調節蛋白新基因 gmi、gfo-1 與 gfo-2，其中以 gfo-2 與 lz-8 序列相似度最低且序列長度亦不同，gfo-1 則與 lz-8 有較高之序列相似度。 將 lz-8、gmi 及 gfo-1 等基因送入 Pichia pastoris KM71 以甲醇誘導方式進行胞外表現，可得重組蛋白 rePLZ、reGMI 及 reGFO-1，MALDI-TOF 分析結果顯示重組蛋白並無任何醣基化現象，最後目標蛋白產量平均可達 300 mg/l culture。甲醇誘導方式使菌體在需氧量以及 H2O2 累積上易造成壓力，因此重組蛋白 rePLZ、reGMI 及 reGFO-1 於表現後期發生蛋白酶水解現象，且此等蛋白酶無法以親和管柱純化方式去除，但 EDTA 與 pepstatin A 等蛋白酶抑制劑可完全抑制重組蛋白之降解。 rePLZ、reGMI 與 reGFO-1 於胺基酸序列的差異反映在蛋白質構形上，西方雜合結果顯示 reGFO-1 與 rePLZ 於構形上具有較高之相似度，而 reGMI 之構形則與 rePLZ 相差較大。rePLZ、reGMI 及 reGFO-1 進行免疫調節活性測定，皆可刺激 BALB/c 老鼠骨髓之樹突細胞（dendritic cells, DCs）分泌 IL-12，也可刺激老鼠巨噬細胞株 J774A.1 分泌 TNF-α 及刺激人類 T 細胞株 Jurkat cells 分泌 IL-2。其中，reGMI 於 5 μg/ml 下可刺激 DCs 分泌 IL-12 的量為相同濃度 rePLZ 之六倍。
- 學位論文
本研究係探討維生素E的補充對自體免疫鼠病情的影響，分別對攝食炸油（10%炸油+5%新鮮大豆油）或一般低油（5%新鮮大豆油）的自體免疫鼠MRL/lpr或NZB/W F1鼠，添加5倍或10倍的維生素E (all-rac-alpha-tocopheryl acetate, alpha-TOC)，追蹤小鼠自體抗體生成、尿蛋白和生命期之變化。並探討是否經由影響氧化壓力、免疫細胞族群、脂肪酸組成，進而影響發炎反應等機轉，以了解維生素E對自體免疫疾病的利弊。實驗飼料包括：炸油 (SF)、炸油補充10倍維生素E (SFE10, SF + 550mg/kg)、低油 (E1)、低油補充10倍維生素E (E10, 5%新鮮油+ alpha-TOC 500mg/kg) 或缺乏維生素E (E0)。結果顯示，炸油添加10倍維生素E對MRL/lpr與NZB/W F1自體免疫小鼠，有益於延緩小鼠病情惡化，在NZB/W F1鼠延長生命期達顯著差異。缺乏維生素E與炸油飲食，皆會造成紅血球溶血增加與組織TBARS上升，炸油補充維生素E，可顯著增加組織中維生素E含量，降低組織TBARS與紅血球溶血率，抗雙股DNA抗體生成較低，但新鮮油添加維生素E則無顯著變化。雖然缺乏維生素E增加組織氧化壓力，但抑制B細胞增生反應，降低自體抗體生成。在脂肪酸組成方面，SFE10飲食會抑制脾臟細胞脂肪酸LA衍生成AA，可能降低促發炎介質PGE2衍生，但本實驗結果未達顯著性。對免疫細胞的影響，E0與SF飲食，增加T細胞比例，促進IL-2分泌。SFE10組、E10組或ED組均顯著抑制IFN-gamma與IL-6的分泌，減少MHC II的表現，可能為降低自體抗體生成的原因。E10會降低NZB/W F1鼠脾臟細胞自發性IL-2的分泌，與前報導MRL/lpr鼠動物及細胞實驗，高劑量維生素E顯著抑制鼠脾臟細胞IL-2的分泌結果一致。 因此，由體外添加維生素E細胞培養，探討高劑量抑制IL-2分泌的影響機制，是否透過增加Th1的細胞凋亡或抑制IL-2的訊息傳遞。故利用OVA-specific Tg轉殖小鼠分離培養已分化的Th1與Th2細胞，探討
- 學位論文
絞股藍（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino）為葫蘆科（Cucurbitaceae）絞股藍屬多年生宿根性蔓生草本，因其含有近九十種與人參皂甙結構類似之化合物而深受矚目。 本研究以農桿根群菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC 15834對絞股藍葉片外植體進行感染，並成功誘導產生毛狀根。經PCR確認後，選取生長快速、分支多之毛狀根系進行單株化。比較7株毛狀根單株在不同基礎培養基之生長狀況及絞股藍皂甙產量之差異，最後選定高產性毛狀根系GP-01。以MS為基礎培養基，探討毛狀根生長與二次代謝物累積之動態變化，培養至49天時，毛狀根乾重7.3 g L-1，皂甙含量為乾重之3.8%，總皂甙生產之動態變化類型呈明顯的”生長相關”特性，總皂甙產量最高可達280 mg L-1。毛狀根培養過程中並無絞股藍皂甙釋放至培養基。 激發因子可以誘導植物產生植物防禦素（phytoalexins），因此成為提高植物毛狀根之二次代謝物產量的一種方法。本研究探討不同來源激發因子對絞股藍毛狀根生長及皂甙生合成之影響。實驗結果顯示，激發因子之作用效果與激發因子之種類、濃度、作用時間及毛狀根之生長狀態有關。以茉莉酸甲酯（MJ）的誘導效果最好，最適作用濃度為200 μM。毛狀根在對數生長末期對MJ之作用最敏感。在加入200 μM MJ 3天後收穫，毛狀根中皂甙之含量達4.5% DW，比對照組（3.7% DW）提高21%。 針對基礎培養基內各主要成分對絞股藍毛狀根生長及皂甙生合成之影響進行了研究，確定了生長（growth medium, GM）及生產（production medium, PM）培養基配方。絞股藍毛狀根先以GM培養基培養38天，繼之以PM培養基繼續培養18天後收穫。證實以二階段培養方式確實可有效的促進絞股藍皂甙之生產，使總皂甙產量比GM一階段培養增加126%。 欲利用生物反應器進行毛狀根高密度培養時，如何實現毛狀根接種的自動化與均勻化以及如何有效提高反應器之空間利用率將是生物反應器實用化的關鍵因素。本研究利用均質機將毛狀根切成適當長短，再接種入反應器。不僅操作手續簡便、製程放大容易，同時在反應器中設置不?袗?網作為毛狀根生長之支撐介質，使毛狀根能充分利用反應器空間生長，達成高密度培養之目的。比較絞股藍毛狀根在三種不同型式生物反應器：氣泡塔式反應器（bubble column）、改良的機械攪拌式反應器（modified stirred tank without impeller）及機械攪拌式反應器（stirred tank with impeller）之生長及皂甙生合成狀況。結果發現毛狀根在氣泡塔式反應器及改良的機械攪拌式反應器中之生長速率及皂甙含量均優於機械攪拌式反應器，同時毛狀根在氣泡塔式反應器及改良的機械攪拌式反應器中之生長分佈亦比機械攪拌式反應器均勻。絞股藍毛狀根之擴大培養在改良的機械攪拌式反應器得到較好之結果，以MS為基礎培養基在25℃培養50天後，得到生物量乾重為7.1 g L-1，與三角瓶實驗結果相差無幾。而總皂甙含量4.7%DW，則明顯優於三角瓶實驗結果。 本研究從絞股藍毛狀根培養獲得遠比原植物根部含量高出許多之絞股藍皂甙，證實毛狀根具有合成與原植物相同或類似水準之二次代謝物的能力。雖然絞股藍毛狀根之皂甙含量低於市售品10~30%，但傳統生產方式一年只有1~2穫，且受自然環境及栽培條件等之影響，品質難以均一。與傳統栽培方式相比，利用反應器進行毛狀根擴大培養則可全年生產，因此具有很大的發展潛力。 本研究證實，利用毛狀根培養生產二次代謝產物，提供了可靠、全年生產、不受地區、緯度、氣候、季節、土壤污染、病蟲害的威脅以及政治因素之影響。生產製程的主控權完全由培養者掌控，培養者可以透過毛狀根系的選擇及培養基的最適化來提高產率，除了降低生產成本外，也能提高產品品質。因此，利用毛狀根培養生產高價值之植物二次代謝產物（如絞股藍皂甙）未來具有很大的發展潛力。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。
- 學位論文
嗜水性產氣單胞桿菌為革蘭氏陰性、兼性厭氧性菌，廣泛的存在於各類水域之中，一般被視為伺機性病原菌，對於人類及動物均有致病力。由於目前為止仍然缺乏適當的選殖系統可供研究其基因功能，所以本研究的目標是利用 Aeromonas 屬內生質體與大腸桿菌之載體融合，建構成複製區域選殖載體。爲得到 Aeromonas 屬內生質體，因此我們檢測 Aeromonas 菌株之臨床及環境分離株共70株之質體存在，發現有 4 株臨床株及 4 株環境株帶有質體。所有質體以限制酶進行切割，由其切割後之片段與標準品比較計算質體的大小，分別為：臨床株中 pAH 32為17 Kb、pAH 35為15kb；環境株中pAH 132、pAH 169、pAH191均為2.4kb。再選取其中限制酶切位較多之質體pAH 35為研究對象，將其切割成適當之片段與載體融合，製作成找尋複製區域之質體。我們將質體送入大腸桿菌複製放大數量後，再利用電穿孔法轉形入嗜水性產氣單胞桿菌，利用抗生素作為標記篩選出帶有嗜水性產氣單胞桿菌質體中複製區域的重組質體。利用網路核酸資料庫 NCBI 比對其序列，發現其與 Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida strain A449.質體 pAsa2有極高之相似性。該質體為ColE1-type plasmid ，因此本質體亦可能為 ColE1-type plasmid，我們針對此質體探討其複製起始點，並製作穿梭載體。本實驗中，質體pAH35的複製區域尚未得到證實。
若您是本文的作者，可授權文章由華藝線上圖書館中協助推廣。