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以酵母菌雙雜合系統篩選阿拉伯芥中與 AtMAPRs 有交互作用之蛋白質

我們在阿拉伯芥中發現四個與豬的 MAPR (membrane associated progesterone receptor conponent 1) 有同源性的蛋白質,並命名為 AtMAPR2、AtMAPR3、 AtMAPR4 與 AtMAPR5。雖然對此四個蛋白質的功能缺乏全面性的了解,但我們 推測 AtMAPRs 參與調控環境中訊息的接收,例如植物本身分泌的荷爾蒙、光照或 逆境。本實驗室先前的酵母菌雙雜合實驗結果顯示,AtMAPRs 可能與聚泛素 (polyubiquitin)、MYB3 轉錄因子、GTP 結合蛋白質 (AtTOC33) 以及丙胺酸-乙醛酸 轉胺? (alanine-glyoxylate aminotransferase,AGT1)。然而,AtMAPR3、AtMAPR4 與 AtMAPR5 所含有的推測性穿越膜區塊 (putative transmembrane domain) 可能影響 酵母菌雙雜合的結果。因此,我們使用除去一到四十個胺基酸的 AtMAPR5 當成釣 餌,透過酵母菌雙雜合系統來篩選主要以阿拉伯芥花製成的 cDNA 庫 (CD4-30)。 在二十六個分別可能與 AtMAPR5 有交互作用的蛋白質中,推測 C3HC4-type RING 蛋白質 (At3g58030) 與一種 FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (AtFKBP16-2; At4g39710) 可能分別直接與 AtMAPR5 在阿拉伯芥中一同發揮其效 能。根據這兩個可能與 AtMAPR5 產生交互作用的蛋白質,我們提出兩套模型來解 釋 AtMAPRs 可能的作用機制:(一) C3HC4-type RING 蛋白質可能具有 E3 ligase的 活性並且藉者調控 AtMAPRs 的降解而達到傳遞訊息的功能。(二) AtMAPRs 可能 於光合作用 (photosynthesis) 中與 AtFKBP16-2 一同扮演電子傳遞者的角色。許多工 作仍須繼續進行來證明此二假設的真實性。簡言之,酵母菌雙雜合系統的結果提供 許多資訊讓我們對 AtMAPRs 的功能做進一步的推測。

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綠竹無性芽及花芽之蛋白質體分析

竹類植物開花後集體死亡的現象，相當令人好奇。為探討這種現象，必須先瞭解造成竹類植物開花的原因。本論文使用試管中綠竹花芽及無性芽作為研究材料，結合二維膠體電泳、抗體免疫染色、電腦軟體比對、螢光標定及質譜分析作為研究工具。經比較綠竹無性芽及花芽，針對差異蛋白質進行成份鑑定後，發現綠竹花芽體內，合成Val、Leu和Ile的相關酵素含量降低，而降解Tyr、合成Gln及Cys的酵素含量提高。此外醣類代謝方面，可得知花芽內參與TCA循環、糖解及光合作用的酵素增加，推測其醣類組成可能改變。還有合成脂肪酸的酵素含量也增加，顯示花芽內部脂肪酸含量上升。另外發現抗氧化、滲透逆境相關之酵素，其含量也在花芽中提高，而這些酵素可能會與植物荷爾蒙結合，調控植物生長發育。上述推測造成綠竹開花的可能原因，均有待進一步研究。

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綠竹筍細胞分裂素受體cDNA之選殖與分析

在植物中已知有九種賀爾蒙，參與調節植物代謝、生長、以及發育過程；細胞分裂素為一種腺嘌呤衍生物，在腺嘌呤的第六個氮上有不同的取代基。細胞分裂素在植物中扮演許多不同生理功能角色，如：促進細胞分裂、頂端優勢、根部生長與分枝、葉綠素的生合成及葉的老化作用等。目前阿拉伯芥中有三個被確定的細胞分裂素受體AHK2、AHK3及AHK4/CRE1，皆屬於複合型的組胺酸激酶受體，其中組胺酸激酶受體在原核生物或植物中被認為能夠啟動二元訊息傳導系統。綠竹具有生長迅速的特性，在多雨的夏季開始大量發筍，豐沛雨水可能會造成生存條件變化，如：滲透壓的改變。酵母菌當中的SLN1被認為與感應滲透壓變化相關，在互補 (complementary) 實驗當中，將CRE1轉入酵母菌SLN1剔除突變株，外加細胞分裂素可以拯救致死突變株。我們想要瞭解綠竹中可能的細胞分裂素受體所扮演的生理角色，本論文主要目標即為綠竹筍細胞分裂素受體cDNA之選殖與分析。利用非放射線標定不同組織差異性表現片段DIG-GA作為探針，由王愛玉博士實驗室提供之綠竹筍cDNA庫當中，篩選出可能為細胞分裂素受體之基因。在第一次的篩選，由106個clone中篩出四個正反應株，以聚合酶鏈鎖反應進行初步確認後，挑選兩個正反應株進行後續篩選。經過四次篩選確認，最後選殖出可能為細胞分裂素受體之cDNA，命名為BPCRE。序列分析結果顯示BPCRE包含3578 bp，與水稻中可能為組胺酸激酶的蛋白質、及玉米的組胺酸激酶之cDNA分別有96%及90%的相似度。然而，BPCRE缺乏5’端非胺基酸轉譯區域及一小部份的胺基酸轉譯區，且包含一段40 bp大小、可能為intron的片段。BPCRE所轉譯出的蛋白質可能包含有三個 α 螺旋構形的疏水性穿膜區域、一個CHASE功能區塊、一個組胺酸激酶功能區塊及一個receiver功能區塊。利用北方雜合法分析BPCRE在不同生長時期及不同組織部位竹筍表現情形，發現BPCRE之mRNA幾乎完全只表現於竹筍頂端分生組織，與差異性表現分析的結果可互相呼應；此外，由於頂端分生組織具有持續細胞分裂之特性，這暗示著BPCRE在此過程中扮演重要的角色。

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甘藷塊根L型澱粉磷解脢激脢之純化與性質分析

甘藷塊根L型澱粉磷解脢 (L-SP, EC 2.4.1.1) 中央序列 (L78) 斷裂後，可提高對於澱粉的親和力。以電腦程式PC/GENE分析L78，預測此序列包含有一段易受到蛋白脢攻擊的PEST site以及數個可能受到磷酸化修飾的位置。本論文利用純化自甘藷塊根L-SP作為基質，篩選甘藷塊根蛋白質中可對L-SP進行磷酸化作用的激脢。根據專一性免疫沈澱法的實驗結果顯示：L-SP確實可受到甘藷塊根中內生性鎂或錳需求型蛋白質激脢的磷酸化修飾，因此利用硫酸銨分劃以及三種不同性質的管柱層析法，將此一激脢自甘藷塊根粗抽液中純化分離至部份均質，命名為L型澱粉磷解脢激脢 (LSK)。將LSK以Native/SDS二次元電泳解析，再配合質譜儀鑑定，發現當中含有顯著Ser/Thr蛋白質激脢訊號。此一激脢的原態分子量，經膠體過濾法以及膠體內激脢分析法估計為338 kD。LSK的活性可受到蛋白質激脢抑制劑staurosporine的抑制，而L-SP的磷酸化可被來自於牛腸胃道的鹼性磷酸脢去磷酸化。使用不同的L-SP片段作為LSK的基質，發現LSK針對含有L-SP中央序列的表現蛋白質L78P作用。磷酸化胺基酸分析結果顯示LSK是針對L78序列的Ser進行磷酸化修飾。針對L78P正常株的定點突變結果，則確認LSK針對L78的Ser527進行磷酸化修飾。磷酸化的L-SP在試管中的結果顯示：L-SP的磷酸化修飾會導致L78的移除，但是並不會改變本身的酵素動力學參數。根據本論文結果顯示：LSK對於L-SP的磷酸化修飾在澱粉代謝中扮演著重要的調節性角色。

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裂殖性酵母菌 S. pombe 2476 鎘誘導蛋白質之 純化與性質檢定

裂殖性酵母菌 Schizosaccharomyces pombe ATCC 2476 生長在 1 mM 鎘濃度環境下，仍能維持細胞生長。經由 HPLC 分析結果，得知 ATCC 2476 在鎘的誘導下，並不會產生 PC 與鎘螯合。將其細胞粗抽液經一連串純化步驟與製備式電泳溶離，再以二維圖譜分離，挖出可與鎘結合的若干色點進行質譜分析 LC-MS/MS，所得到蛋白質身分，與基因庫資料序列比對，得知所誘生之鎘結合蛋白質為：cyclophilin, nuclear transport factor 2 (NTF2), cyclin-dependent kinase regulatory subunit (CKS), 2,3-bisphosphoglycerate -dependent phosphoglycerate mutase, thioredoxin (Trx1) 及WD 蛋白質。推測當裂殖性酵母菌細胞受到外來鎘離子逆境時，thioredoxin 先與鎘離子結合：當過多鎘離子進入細胞質，會在細胞質中產生大量自由基，此時具抗氧化能力之 thioredoxin 及 cyclophilin 可能會形成第二道防線消滅自由基。

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大腸桿菌植酸酶於重組酵母菌Pichia pastoris中大量表現之研究

植酸酶可分解植酸為一常用之飼料添加酵素，本研究以AOX1啟動子系統於重組酵母菌Pichia pastoris大量生產Escherichia coli之植酸酶。除了以甲醇誘導調控之AOX1啟動子系統外，在P. pastoris表現系統中還有另一個持續表現模式之GAP啟動子系統。本研究中成功利用乳糖操縱子系統（lac operon）調控GAP啟動子之表現。利用AOX1啟動子表現E. coli植酸酶基因時，須以BMGY培養基培養至生長定常期後再以含甲醇之誘導培養基BMMY置換生產。若BMGY中不添加蛋白腖、酵母氮源對菌體生長影響不大。而移除誘導培養基BMMY中酵母氮源與蛋白腖並將酵母膏濃度降為原配方十分之一 (0.1%)更有助於植酸酶之生產。將P. pastoris以修飾培養基mBMGHY培養再以誘導培養基mBMMHY置換誘導P. pastoris生產植酸酶，可提高植酸酶產量並降低生產成本。甲醇濃度對P. pastoris在醱酵槽誘導植酸酶生產過程中非常重要，在醱酵槽中利用甲醇控制儀器監控控制培養基中甲醇濃度為0.5%，提供菌體穩定之碳源與誘導物可有效提高植酸酶產量。批次醱酵誘導生產後之菌體可離心回收再次進行誘導生產植酸酶，且以回收菌體進行第二與第三批次之誘導生產，由於回收利用之菌體在誘導過程中已經適應了甲醇之代謝，其植酸酶生產速率皆高於第一批次生產，降低生產成本與時間。P. pastoris以全合成培養基FBSH於5公升醱酵槽中培養，並經過甘油饋料批次培養後，培養液之OD600與生菌數分別為321與2.6 x 1010 CFU/mL。將菌體離心回收，懸浮於mBMMHY誘導培養192小時後，胞外蛋白質產量達6.4 g/L，植酸酶活性則為4,946 U/mL。 P. pastoris之GAP啟動子為持續表現之強力啟動子，可能會在培養過程中影響菌體之生長，故本研究利用E. coli之乳糖操縱子系統來調控GAP啟動子之表現。將乳糖阻遏物（lac repressor, LacI）基因轉形至P. pastoris宿主中，建構一可於胞內表現乳糖阻遏物之菌株P. pastoris KM71I。將乳糖操縱基因（lac operator, lacO）插入GAP啟動子不同位置，並將E. coli植酸酶基因接至GAP-lacO融合啟動子下游作為報導基因。在ATG轉譯起始點前214 bp位置插入lacO序列造成表現量下降50%，顯示此位置對GAP啟動子表現扮演著重要角色。若於GAP啟動子下游之ATG轉譯起始點前插入lacO序列，對GAP啟動子於P. pastoris KM71表現強度影響不大，但於乳糖阻遏物表現宿主P. pastoris KM71I中，則表現活性明顯受到抑制降為22%。培養基中添加IPTG可成功誘導lacO-GAP融合啟動子之表現，而在10 mM IPTG濃度下表現量可回復為88%。本篇為首篇利用乳糖操作子系統成功調控GAP啟動子之研究。

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楊桃酒品質改善之研究

中文摘要： 取三栽培品種 (秤錘、青墘[產季中]、青墘[產季末]、甜味種馬來西亞八號) 楊桃（Averrhoa carambola L.）分別以全果切片、全果泥、以及全果榨汁進行小規模釀造，第10天或第30天進行第一次轉桶去渣，之後進行消費者官能品評，以選出最佳之釀酒條件，再進行楊桃酒之大量釀造，釀成之楊桃酒進行各式貯存條件之探討。貯存條件以溫度、填充氣體、容器、添加澄清劑以及避光等變因進行探討。結果顯示以秤錘種楊桃進行全果切片所釀造之楊桃酒最佳。秤錘種楊桃釀造者口感較佳，青墘[產季中]、青墘[產季末]以及馬來種楊桃都有口感酸澀的現象。釀造方式以全果切片進行釀造者口感較為圓潤爽口，而以全果泥釀造者則較為酸苦，風味較為強烈，以全果榨汁釀造者風味清淡，且發酵所需時間較長。發酵10天以及30天之後進行第一次轉桶進行比較，兩者在統計上並無顯著差異，實際品嚐上發酵30天者風味較為強烈且口感較酸苦，發酵10天者風味與口感皆適中。以25℃(室溫)、充CO2、玻璃瓶、不添加澄清劑以及不避光處理者為較適之貯存條件。

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甘藷塊根澱粉磷解脢高溫下階段式降解之探討

植物的L型澱粉磷解脢 (L-form starch phosphorylase, L-SP) 在其分子中央，較動物的肝醣磷解脢多出一段由78個胺基酸組成的片段 (L78)。因為胺基酸序列及結構特殊的關係，L78極易斷裂，造成L-SP分子裂解成兩群分子量 (約50 kD) 相近的片段 (統稱F50s)。將甘藷塊根切片加熱至45℃ 以上會使L-SP之泳動率改變，產生規律之階段式降解；隨著加熱反應時間的增加，Anti-L78P抗體最早失去辨識L-SP的能力，因此推論降解過程乃先移除中央之L78；接著J3b無法辨識L-SP，因此降解由L78繼續朝N-端方向進行，而H7c結合的區域 (L-SP之C-端) 較少發生降解。在甘藷塊根加熱過程中，當溫度與濕度到達一定程度，甘藷塊根切片便產生糊化現象：由掃描式電顯得知，溫度處理造成澱粉粒破裂。此外，由切片上不同區域的原態電泳檢定，發現糊化與L-SP的降解有正相關性：且隨著甘藷切片糊化程度的不同，L-SP產生階段式降解。因此我們推測，甘藷切片在高溫處理下，內部的澱粉粒因糊化而破裂，當胞器破裂後，L-SP被其他酵素降解機會增加，因而產生所觀察到的階段式降解。

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利用基因重組大腸桿菌表現海鱺淋巴囊腫病毒 之主要鞘蛋白及其單株抗體生產與分析系統之建立

本論文以罹患淋巴囊腫病的海鱺為材料，自數種組織及器官分離出基因組DNA (genomic DNA)後，設計專一性引子並進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)，以偵測並放大主要鞘蛋白的DNA序列mcp，經由定序後可知此段序列長度為1295個鹽基(base pair)，利用Bioedit軟體分析其限制切位圖譜(restriction map)以及下游轉譯胺基酸序列組成，推測其下游產物分子量應介於45至50 kD之間。 自含有病毒的器官及組織中分離出病毒顆粒，進行免疫以生產單株抗體，免疫方法包括傳統法以及快速免疫法(RIMMS)，將免疫完成的小鼠脾細胞取出，與骨髓癌細胞NS-1利用PEG 1500進行細胞融合，以HAT(Hypoxanthine、Aminopterin、Thymidine)培養液進行選擇性培養，並以酵素免疫分析法(ELISA)篩選出具分泌抗淋巴囊腫病毒主要鞘蛋白之融合瘤(hybridoma)細胞，共獲得3C6抗體與2A10抗體兩株高效價的單株細胞。分型結果顯示3C6的重鏈為IgG1而2A10的重鏈為IgG2a，兩者的輕鏈均為κ。其中3C6單株細胞生長快速且分泌出的抗體效價較高，以之作為生產抗體細胞株。將其產生的單株抗體進行純化。步驟包括先以硫酸銨沉澱後，以DEAE-Sepharose離子交換樹脂與Protein-G管柱進行親和性層析，再以原態膠體電泳、變性膠體電泳(SDS-PAGE)與ELISA進行分析。 最後將mcp基因以pQE31表現載體於大腸桿菌DH5α中進行蛋白質生產，pQE31上帶有His-tag，因此重組蛋白質可利用Ni-NTA親和管柱進行純化，純化後的MCP蛋白質經由SDS-PAGE分析後可知其分子量約48kD，而經由ELISA與西方墨點染色(Western blotting)而知其可與單株抗體3C6結合。 以單株抗體進行海鱺淋巴囊腫病毒主要鞘蛋白的檢測，利用間接ELISA的方式，將純化後的3C6抗體經稀釋104倍後使其與不同濃度的MCP進行結合並呈色，實驗結果顯示檢測範圍介於0.5至5 μg/mL 時有良好的線性關係，可偵測MCP的極限為0.5 μg/mL。 由以上結果可知，針對淋巴囊腫病毒主要鞘蛋白之單株抗體可應用於進行病毒顆粒的檢測，並可能進一步發展如免疫反應型生物感測器等快速檢測平台。此外，利用基因重組大腸桿菌大量生產主要鞘蛋白MCP，亦具有發展成魚用疫苗的潛力。

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綠竹筍蔗糖磷酯合成酶在酵母菌中之表現

蔗糖磷酯合成酶 (sucrose phosphate synthase，簡稱SPS) 為高等植物調控蔗糖生合成之重要酵素。本論文目的，即希望以具真核細胞轉譯後修飾作用之表現系統，表現綠竹筍蔗糖磷酯合成酶(BOSPS)。 首先，依據BOSPS cDNA 之5‘及3’ 端序列，設計含特定限制酶 (NotⅠ及ApaⅠ) 切位之引子，利用聚合酶鏈鎖反應 (PCR)，即得兩端分別具 NotⅠ 及 ApaⅠ 切位之BOSPS cDNA；將此cDNA 接入T載體yT&A，轉形至大腸桿菌 (JM109) 中保存。續以限制酶NotⅠ及ApaⅠ將其自T載體切下，與經相同限制酶處理之pPICZ A表現載體接合(pPBOSPS)後，轉形至大腸桿菌 (JM109) 進行定序分析；待序列確認無誤，以限制酶 SacⅠ將此重組表現載體切成線狀，轉形至Pichia pastoris 中 (X-33)。 確定酶母菌轉形株表現型及最適表現時間點後，即可以甲醇誘導BOSPS大量表現；繼則以10~30% PEG沈澱及鎳離子親和層析管柱純化之，所得酵素則可分別進行各項生化性質分析。