• 學位論文

綠竹筍苯丙胺酸脫氨裂解酶在酵母菌中之表現與檢定

苯丙胺酸脫氨裂解酶 (phenylalanine ammonia lyase, EC 4.3.1.5，簡稱 PAL) 為連結一次代謝與二次代謝的關鍵酵素，其催化 L-phenylalanine 進行非氧化性脫氨產生 trans-cinnamic acid，為 phenylpropanoid 衍生物生合成途徑上第一個反應。 酵母菌 Pichia pastoris具有高等真核表現系統之許多優點，如蛋白質之加工、折疊以及後轉譯修飾作用，並有如 E. coli一般容易操作。故在本研究中，我們用Pichia pastoris 蛋白質表現系統進行 PAL 的表現。將綠竹筍 Bopal 1 與 Bopal 2 cDNA 片段經由 PCR 反應放大，先建構保存型質體 pGEM®-T/Bopal 1與 yT&A/Bopal 2，再選殖進入表現載體 pPICZ A，建構出表現質體 pPICZ A/Bopal 1 與 pPICZ A/Bopal 2。兩個表現質體以限制酶分析酶切圖譜，及定序方法分析核酸序列的正確性，再轉形進入 Pichia pastoris (X-33)。 兩種表現系統產生 C 端帶 (His)6-tag 的融合蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2，可經鎳離子螯合的膠體純化得到。經 SDS-PAGE 測得表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2，兩者單元體分子量約為 80 kD；以膠體過濾層析法測得表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 原態分子量約為 323 kD 與 331 kD，推測兩者為同質四元體酵素。表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 對基質 L-Phe 之 Km 質分別為 1.01 mM 與0.33 mM。表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 最適反應溫度為 50℃，最適反應 pH 為 9.0。表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 活化能分別為 10.4 kcal/mol 與 12.8 kcal/mol；酵素活性會受到汞、鎳、鈷、鐵離子的抑制。二次代謝產物，如 trans-cinnamic acid 及 tannic acid，具有產物回饋抑制現象。酵素之 seryl、tyrosyl、histidyl 基團為表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 催化作用所必需。表現蛋白質 BoPAL 2 具有 TAL 的活性。在本實驗中，我們認為 BoPAL 1 與 BoPAL 2 經酵母菌表現後，與綠竹各部位 PAL 具有相似的生化性質，但是表現蛋白質 BoPAL 1 對於基質具有較差的親和力。與大腸桿菌表現蛋白質 BoPAL 1 與 BoPAL 2 比較，經由轉譯後修飾，催化活性雖低於大腸桿菌表現蛋白質，但酵素構形卻較為穩定。

• 學位論文

磷酸化修飾對甘藷塊根 L 型澱粉磷解脢之影響

轉譯後修飾 (post-translational modifications) 乃生物細胞調控蛋白質功能的主要方式。目前已知甘藷塊根L型澱粉磷解脢 (L-SP) 會受到磷酸化 (楊光華,2005) 及蛋白裂解修飾 (陳翰民,1997)，而本論文即探討這兩種修飾對L-SP活性之影響。磷酸化修飾並未明顯影響L-SP需醣引子合成澱粉及磷解澱粉之活性，但是可加速L-SP中央L78降解的速率。所以磷酸化修飾可能是加速降解L78的訊號，而並非是影響L-SP催化效率的調控方式。L78降解後，由需醣引子合成澱粉活性之動力學結果發現，L-SP對可溶性澱粉的親和力增加，對Glc-1-P親和力則小幅下降，但未顯著影響L-SP催化能力。過去本實驗室認為L78的降解可能是將L-SP的活性，自合成澱粉方向轉變為磷解澱粉之角色的調控方式，但由本論文觀察L-SP磷解澱粉之動力學結果，發現L-SP對可溶性澱粉的親和力依然提升，對磷酸親和力不變，也不會明顯影響L-SP磷解澱粉的活性。 另外，探討L-SP不需醣引子合成直鏈醣活性時，發現磷酸化修飾及L78移除會明顯降低其催化效率，令我們認為L-SP催化不需醣引子合成直鏈醣的活性區，與催化需醣引子合成澱粉及磷解澱粉的活性區不同。同時，我們推測L78可能就是催化不需醣引子合成直鏈醣的活性區。

• 學位論文

以複合酵素系統配合碳漿電極開發電化學式總膽固醇生物感測器

人體血液中總膽固醇的含量是判斷體內脂質代謝是否異常的指標，過高可能有冠狀動脈硬化、糖尿病或甲狀腺機能減退等徵兆；過低亦有貧血、憂鬱症或罹病率、死亡率高的可能。 本研究主要目的是開發一電化學式生物感測器用以檢測血清中總膽固醇。先以自製碳漿電極對各種電子傳遞媒介物以循環伏安法（cyclic voltammetry）及電流法（amperometry）來評估其效用及進行電極之電化學處理，實驗結果顯示自製之碳漿電極配合三種不同的電子傳遞媒介物皆可有效降低檢測 H2O2 之工作電壓，並選擇以K3Fe(CN)6 作為後續試驗。後續實驗以市售網版印刷技術製作之可拋棄式平版碳漿電極（screen-printed carbon paste electrodes），配合膽固醇氧化酶（ChOx）、膽固醇酯酶（ChE）及電子傳遞媒介物K3Fe(CN)6共同構成檢測系統。實驗中各酵素及電子傳遞媒介物以物理性吸附的方式固定於電極表面，並探討系統最適操作條件，分別選定操作電位為 0.2 V、pH 7.0 、7.5 mM K3Fe(CN)6、1.2 % Triton X-100、1.0 Unit ChOx及1.0 Unit ChE。於室溫下操作，可測得膽固醇線性範圍至333.3 mg/dl，R2＝0.995，而可測得膽固醇酯線性範圍至 100 mg/dl，R2＝0.951。此生物感測器所檢測的線性範圍可涵蓋血液中游離膽固醇之正常範圍。

• 學位論文

綠竹筍乙烯受體之組胺酸激酶功能區塊的表現與檢定

綠竹筍乙烯受體BERSJ2之組胺酸激酶功能區塊類似於細菌之二元訊息傳導系統之組胺酸激酶，並包含所有決定激酶活性保守區域 (motifs)。本論文以 Pichia pastoris 表現BERSJ2中HK功能區塊 （BHK）之重組蛋白質以研究其功能，並進一步以N端定序確定重組蛋白質之正確性，且經實驗確定BHK具有自我磷酸化之功能。為了探討組胺酸激酶功能區塊中用以接受磷酸根所必須保守存在之組胺酸所扮演之角色，本論文亦利用點突變法將保守存在H box中之His置換為Gln，並表現此重組蛋白質- BHK(H23Q)。有趣的是，經進一步分析激酶活性時發現 BHK(H23Q) 並未因His被突變而抑制其自我磷酸化之功能。此外，磷酸化胺基酸之酸鹼穩定性之結果顯示，磷酸化之BHK與BHK(H23Q) 皆可穩定存在於3M NaOH 與 1M HCl 溶液中，由此可知，BHK內被磷酸化之胺基酸可能為serine、threonine或是tyrosine。因此仍需進一步證實綠竹筍乙烯受體BERSJ2之自我磷酸化反應確實有別於阿拉伯芥之乙烯受體ETR1。本論文亦利用BERSJ2內GAF功能區塊之重組蛋白質製備綠竹筍乙烯受體之抗體，並以此抗體分析綠竹筍內乙烯受體的表現情形。但由於綠竹筍內乙烯受體蛋白質的表現量過低，故無法直接以免疫染色鑑定綠竹筍內乙烯受體的含量。

• 學位論文

阿拉伯芥熱誘導啟動子於菸草毛狀根之表現

與動物細胞及微生物相較，植物細胞有類似動物細胞的蛋白質後轉譯修飾能力，且培養基成本低，無prion，oncogene及動物病毒或內毒素感染之風險，具有作為優良外源蛋白質生產系統之潛力 (Hellwing et al., 2004)。然而，使用持續性啟動子 (constitutive promoter) 大量表現外源蛋白質，由於某些產物對於宿主可能產生毒性，使外源蛋白無法順利表現。利用誘導性啟動子 (inducible promoter) 調控基因表現，以避免宿主生長受到抑制，將是一理想的途徑。本研究中，我們將阿拉伯芥熱休克蛋白HSP18.2之啟動子(-870∼+120, 990bp, +1 為轉錄起始點) 融合gusA作為報導基因之質體轉殖至菸草毛狀根組織中，嘗試建構外源蛋白質熱誘導表現系統。經抗生素耐性、PCR與GUS活性表現量等篩選程序，從436株毛狀根轉殖株獲得最高表現量細胞株GD-3。其最適誘導表現條件為42 °C、2小時熱處理。於回復27 °C培養後，即可測得所表現GUS之mRNA與蛋白質活性，並於24小時達最大比活性 267.6 nmol MU min-1 mg protein-1。此時，熱誘導的GUS表現量佔細胞內可溶性蛋白質之0.10 %。然而，連續加熱並不會使GUS表現量上升，且產生了GUS活性延遲表現之現象。此外，為確認下游轉譯出的N端序列是否會影響此段啟動子的表現，我們將此段啟動子的-870∼-678及+42∼+120剔除，此經剔除後的啟動子和原先啟動子皆具有相同的HSP18.2 啟動子序列以及5’未轉譯區。經過抗生素耐性、PCR與GUS活性表現量等篩選程序，從576株毛狀根轉殖株獲得最高表現量細胞株22-4，並比較GD-3及22-4熱誘導表現行為。結果顯示，在轉錄過程中，此段序列對於轉錄 GUS mRNA並無明顯差異，在轉譯過程中，則發現具有HSP18.2之N端序列的GUS融合蛋白質，其活性可延長至24小時。在本研究中，我們成功建立了毛狀根熱誘導表現的模式系統，此系統除了可以應用於重要外源蛋白質生產研究外，亦可經由熱誘導啟動子作為植物基因釣取的工具，及RNA干擾技術、或轉殖重要次級代謝酵素進入植物組織，以研究次級代謝路徑。

• 學位論文

甘藷塊根澱粉磷解脢激脢之生化學檢定

磷酸化是常見的蛋白質轉譯後修飾，同時也是訊息傳導中相當重要的一環。相對於動物界肝糖磷解脢 (glycogen phosphorylase, GP) 具有詳細而完整的磷酸化調控系統，植物細胞中相似度極高的澱粉磷解脢 (starch phosphorylase, SP)，卻從未有同樣的發現；直到2004年Tetlow等人才在小麥造粉體中觀察到澱粉磷解脢有被磷酸化修飾的現象 (Tetlow et al, 2004b )。本實驗室楊光華則在甘藷塊根中純化出針對L型澱粉磷解脢的激脢，並命名為澱粉磷解脢激脢 (L-SP kinase, LSK) (楊光華, 2005)。本論文承續楊光華的研究，進一步精製此激脢，並嘗試以二維電泳的方式進行解析，盼能藉以確定其身份；同時更進一步的藉由蛋白質陣列的實驗，嘗試探討此激脢與澱粉磷解脢之間的辨識關係。

• 學位論文

利用根黴菌之深部培養法開發機能性醱酵黑豆食品之研究

本研究利用省產黑豆為原料以根黴菌之液態醱酵法生產機能性醱酵黑豆食品，並對液態醱酵黑豆產品進行功能性檢測及功能性成分分析，以期確立機能性醱酵黑豆產品之醱酵生產體系，開拓省產黑豆在健康食品上之用途為目的。 。 以高效能液相層析法可有效分離四種指標性異黃酮。探討液態醱酵黑豆最佳萃取條件，得知以80% 甲醇萃取可得到最高異黃酮含量及最佳DPPH自由基之清除效應。以黑豆台南三號為基質篩選適合液態醱酵之根黴菌，並檢討液態醱酵期間代謝產物之變化，得知三株檢測菌皆可將帶醣基之異黃酮（daidzin及genistin）經由 β-葡萄醣苷酶之作用轉換成不具醣基之異黃酮（daidzein及genistein）。依據異黃酮轉換效率、自由基清除之效應及醱酵時間等因子，選擇以Rhizopus oligosporus NTU-5為最適液態醱酵菌株。 在擴大生產試驗中，檢討攪拌速率及通氣量對R. oligosporus NTU-5於五公升醱酵槽中液態醱酵黑豆之影響，並分析醱酵期間代謝產物之變化，得知最適液態培養條件為培養溫度，30℃；通氣量，0.1 vvm；攪拌速率，100 rpm；接種量，10% 及醱酵槽裝液量， 3 公升/ 5 公升。 。 以矽膠管柱層析法進行液態醱酵黑豆粗萃液之溶劑沖提，得知以乙酸乙酯：甲醇（2：1; v/v）之區分5具有最大抗氧化活性。以薄層層析法及半製備式高效能液相層析法分離出不具醣基之異黃酮 daidzein、genistein 及具抗氧化活性未知化合物 FBE5-PA。Daidzein 及 genistein 之回收率分別為 90.6% 及 70.5%。未知化合物FBE5-PA對DPPH自由基之有效半抑制濃度（IC50）為 7.5 μg/mL。 液態醱酵黑豆粗萃液之乾燥產物在濃度為400μg/mL時對人類肝癌細胞 Hep 3B 及子宮頸癌細胞 Hela 具有抑制增生之能力，抑制率分別為 61.5% 及 64.4%，對於人類正常肺纖維母細胞 MRC-5 則無顯著抑制效果。

• 學位論文

以菸草細胞生產重組塵蟎過敏原蛋白Der p 2之研究

重組過敏原蛋白已在許多不同系統中表現， 且植物系統被認為是具有競爭力的外源蛋白表現系統。本研究中，從已轉入CaMV 35S啟動子驅動塵蟎過敏原蛋白Dermatophagoides pteronyssinus 2 (Der p 2) 基因的轉殖煙草植株，來誘導癒傷組織與毛狀根，之後分別進行懸浮細胞培養與毛狀根培養，並利用自行建立之Der p 2三明治酵素免疫分析法(sandwich-ELISA)進行定量。從8株懸浮細胞株中挑選出Der p 2產量最高的細胞株S3，搖瓶培養16天，產量為788.3 μg/ L；以生物反應器進行批次培養，產量在第8天即達515.1 μg/ L。在轉植植株誘導毛狀根方面，共得24個細胞株，經30天三角搖瓶培養後，細胞株R19產量為475.2 ng/mL。此外，我們也建構以誘導性啟動子HSP 18.2融合Der p 2之嵌合基因，並在菸草毛狀根中獲得表現。在重組Der p 2蛋白的抽出與純化方面，重組蛋白粗抽液經硫酸銨沉澱、陽離子交換樹酯SP Sephadex、與自行建立之Der p 2單株抗體親合管柱處理後，可獲得以Der p 2為主要蛋白之溶液，收率為19.7 %。

• 學位論文

地黃毛狀根之建立與培養研究

地黃為玄參科植物懷慶地黃之塊根。新鮮的根稱鮮生地，性大寒，味甘苦。曬乾後稱乾地黃，性寒，味甘微苦。生地黃以砂仁和酒拌之，蒸熟後曬乾，稱熟地黃，性溫，味甘。地黃含多種甙類成分，其中以環烯醚帖甙為主，在鮮生地、乾地黃和熟地黃中含量顯著差異，且為地黃的主要活性成份，也是使地黃變黑的成分，如梓醇（catalpol）已被證實具有降血糖的藥效。 地黃的栽培時間大約為一年至一年半，有效成分易隨外在環境不同而有所差異，而利用農桿根群菌（Agrobacterium rhizogenes）感染地黃植株誘導生成的地黃毛狀根，則具有遺傳性質及生合成穩定、生長快速、可控制外在環境等優點。本實驗針對培養環境、植物及細菌等因素進行地黃毛狀根的誘導探討，並以 PCR、GUS 表現以及地黃成分分析來鑑定地黃毛狀根，發現在菌液濃度達 A600 = 0.8、22℃ 下感染地黃葉片外植體（leaf disc）兩天，以 White’s 培養基對地黃毛狀根的誘導率最高，而兩種農桿根群菌（A4, ATCC 15834）對地黃毛狀根的誘導，則並沒有太大的差異。如果在培養過程中，添加植物生長調節素如 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyace- tic acid)，更可以增加毛狀根的誘導率。

• 學位論文

血纖維分解酶subtilisin NAT之醱酵生產研究

Subtilisin NAT，又稱納豆激酶(Nattokinase)，是一種由Bacillus subtilis natto所分泌，具有分解血纖維活性的絲胺酸蛋白酶。本研究中，我們自市售納豆中，經血纖維平板法分離出29株菌株，其中以no. 6 strain具最高血纖維分解活性。探討培養基中蛋白質種類與濃度，及葡萄糖對no. 6 strain生產subtilisin NAT之影響，結果顯示，最適培養基組成為3%大豆與1%葡萄糖。於5 L醱酵槽進行批次培養，並以H-D-Val-Leu-Lys-pNA為基質測定其amidolytic活性。結果顯示，在培養第38小時，可得到最高活性46.5 SU ml-1，此時生菌數為109 CFU ml-1。我們進一步在E. coli中選殖不同長度的subtilisin NAT基因序列 (pre-pro, pro-, mature type)，進行血纖維分解酶之表現與重組蛋白生產研究，發現只有pro-subtilisin NAT基因可順利表現活性，且活性位於胞內。以5 公升醱酵槽中進行pH-state (7.0)饋料批次培養，並於培養第21個小時添加0.02 mM IPTG，同時將溫度自37℃降至25℃，以進行重組蛋白之誘導生產。結果顯示，於培養第24個小時可得最大菌體量(30.5 g l-1)，並於第36小時可得最高活性91.2 SU ml-1，但此時生菌數降至106 CFU ml-1，推測應是受到所表現之subtilisin NAT之傷害所致。經陽離子交換樹脂CM Sepharose Fast Flow與膠體過濾管柱HiPrep 26/60 SephacrylTM S-100 High Resolution進行醱酵液純化，再經蛋白質N端定序及LC-MS/MS分析及資料庫比對，確認此血纖維分解酵素為subtilisin NAT。