臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
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即時定量聚合酶鏈反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time qPCR) 為目前檢測與定量基因改造生物的主要方法，現行較普遍的方法是以質體 DNA 建構標準曲線進而推算基改成份含量的絕對定量法。近期有研究指出環狀 DNA 的構形會影響 PCR 產物的增幅，因此本研究探討超螺旋狀、線狀、缺口性環狀及封閉環狀四種不同構形的質體，在 real-time qPCR 以及一般 DNA 定量上所造成的偏差，並實際進行基因改造玉米 NK603 的定量檢測。本研究選用四種 DNA 定量方法，分別是 O.D. 260 nm 定量法、Hoechst 33258 螢光染劑定量法、Quant-iT 定量法及酵素反應之 HPLC 定量法，結果顯示 O.D. 260 nm 定量法得到較高的定量結果，而質體構形對於 Quant-iT 定量法影響最大。超螺旋狀質體與其他構形的質體，在定量的差異可達 1.62 至 1.88 倍。在 real-time qPCR 的部份，選用四種系統，分別是 SYBR Green I、TaqMan、TaqMan MGB 及 LNA TaqMan，結果顯示無論那一個系統，當質體構形為線狀或缺口性環狀時，real-time qPCR 的測定結果較高，為超螺旋狀質體的 1.9 至 5.4 倍不等，可能是因為質體構形影響前幾個循環的 PCR 增幅效率而造成的。本研究並推論一數學模型討論計算之，顯示超螺旋狀構形的 PCR 增幅效率與缺口性環狀構形相比，可低至 20%，因而造成增幅曲線及標準曲線的差異。若加上先前 DNA 定量的偏差，則最壞情況會產生 10.2 倍的差異。在基因改造成分檢測方面，由於目標基因與內源性基因都是經由質體標準曲線推算，因此定量上的偏差會互相抵消，對於定量基因改造成分方面，質體構形不會造成顯著的影響。但值得注意的是，線狀質體建立的標準曲線可能不足以涵蓋低含量的樣品。本研究結果顯示在使用以質體作為標準曲線進行 real-time qPCR 之絕對定量法時，參考質體的製備與定量方法必須嚴謹，加以標準化，以避免定量結果的不確定性。
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SUMO (small ubiquitin-like modifier) 是一種類泛素蛋白質。其可以藉由共價結合的方式接到目標蛋白質上，以進行轉譯後修飾作用。SUMO化修飾作用需經過一連串由SUMO E1活化酶、E2銜接酶、E3黏合酶所進行的酵素反應。E1活化酶是由SAE1 (sumo activating enzyme subunit 1) 與SAE2 (sumo activating enzyme subunit 2) 兩個次單元體所組成，並負責SUMO化的起始步驟。其功能為將SUMO活化並轉移至E2銜接酶上。 本論文先以酵母菌、人類及阿拉伯芥的SUMO E1活化酶序列進行BLAST分析，並利用AUGUSTUS軟體預測exon-intron找出可能為單胞綠藻 (Chlamydomonas reinhardtii) SUMO E1活化酶的序列。利用專一性引子，本論文成功選殖出SAE1次單元體及SAE2次單元體之部分序列。嘗試不同的表現與純化條件發現，在有GST (glutathione S-transferase) 協助摺疊的情況下，可得到正確表現之重組蛋白。而無論直接使用CrSAE2部分序列或加上CrSAE1和CrSAE2部分序列一起進行in vitro pull down實驗，皆沒有觀察到其與CrSUMO96-GG間之交互作用。本論文亦將表現情形較佳之GST-SAE2部分序列做為抗原，製備SAE2次單元體之多株抗體，以作為未來研究的工具。
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生物體中有許多生化機制被證實是經由G蛋白的訊息傳導進而調控。目前有許多大型的流行病學領域之研究已提供初步的證據，指出G蛋白複合體中的β次元體第三亞型（G protein beta subunit 3, GNB3）可能與高血壓、心血管疾病、中風、糖尿病、肥胖、腎臟病、憂鬱症、偏頭痛、暈眩症等疾病相關。在我們實驗室先前的研究也指出，GNB3在肥胖患者身上的表現量明顯高於一般人，但是它與這些疾病的確切相關途徑仍未確定。基本上，G蛋白的下游訊息傳導主要是由α次元體以及βγ所組成的異次元體分別活化下游的信息傳遞因子。在生物化學領域中，也有少數的研究發表關於GNB3的生化活性及其生理功能，主要是由Rosskopf Dieter所屬之德國團隊，分別在1998及2003年所發現之選擇性剪切變異（Alternative splicing variant）GNB3s及GNB3s2的研究中，在細胞試驗中證實此二種選擇性剪切變異不僅可能造成蛋白質結構的改變，更影響其本身與G蛋白α及γ次元體之交互作用和結合能力，進一步還會改變下游PLCβ2（Phospholipase C beta 2）和MAPK（Mitogen-activated protein kinase）的活性，可見GNB3的確在信息傳遞上扮演著重要的角色。 為了釐清GNB3是否與肥胖有相關性，我們從敏盛醫院和恩主公醫院招募數個接受腸縮減手術的肥胖患者，並詢問其家屬是否願意一起加入本實驗研究。我們採集同意者的血樣進行進一步的純化和分析，將受試者的GNB3基因進行PCR放大並且定序分析其基因變異。我們發現這些肥胖家族成員都含有不只一種GNB3的選擇性剪切變異，且有兩個出現頻率非常高的單一核酸多形性G814A和C825T。對於這個現象，我們進一步分析不同的基因變異是否造成GNB3的生理活性改變。 利用細胞表現的系統，我們用腺苷酸環化酶激活劑(forskolin)直接活化腺苷酸環化酶(Adenylyl cyclase)，再將GNB3基因轉染(transfect)進細胞中表現。細胞中的環腺苷酸(cAMP)量會因為加入10μM forskolin活化而顯著升高，但是否轉染GNB3基因對細胞的環腺苷酸沒有顯著的影響。因此我們轉而測試另外一個信息傳遞的成員，有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)。細胞受到不同時間的forskolin刺激，會影響有絲分裂活化蛋白激酶的磷酸化(pMAPK)程度。沒有轉染GNB3的細胞受到forskolin的刺激會很快的增加pMAPK的量，但有轉染GNB3的細胞則會比較平緩的活化pMAPK。如果我們在細胞轉染先前純化出的不同GNB3基因變異型，可以發現不同的變異型會受到forskolin不同程度的活化。刺激前後的pMAPK量的改變從1.10到17.51倍不等。因此我們推測，肥胖家族的確有許多選擇性剪切變異存在，這些變異可能會經由改變細胞中MAPK的活化，進一步影響生理機制而造成肥胖。
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泛素與類泛素蛋白質修飾系統是利用類泛素胜肽酶、E1活化酶、E2銜接酶、甚至是E3黏合酶的作用，才能將這些小分子量的蛋白質修飾分子接至目標蛋白質的Lysine上。對人類、阿拉伯芥及酵母菌之類泛素蛋白質胜肽酶的相關研究，已經有相當多的文獻發表；相較之下，單胞綠藻在此方面的研究則仍未見。 因此，本研究致力於單胞綠藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 中類泛素蛋白質胜肽酶的身分鑑定與生化性質分析。利用人類及阿拉伯芥類泛素蛋白質胜肽酶之序列對單胞綠藻資料庫進行搜尋與比對後，以專一性引子成功選殖出具有NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 8) 專一性蛋白酶活性之蛋白質，並將其命名為C. reinhardtii deneddylase-1 (CrDEN1)。另外，本研究成功從單胞綠藻中選殖出N端為泛素與C端為NEDD8的特殊融合蛋白質C. reinhardtii Bi-ubiquitin (CrBi-Ub)。其能作為去泛素化酵素與NEDD8蛋白酶的受質。進一步利用CrBi-Ub之定位點突變及人類的USP2-core (ubiquitin-specific protease 2 catalytic core)與SENP8 (SUMO-specific protease 8) 來進行泛素與NEDD8蛋白酶酵素專一性的研究，發現第51號與72號之胺基酸對CrDEN1在專一性分辨泛素與NEDD8上扮演重要的角色。除此之外，本實驗所選殖到的Ubl-specific peptidase-279 (CrULP-279) 可能是一種SUMO蛋白酶，而未知其基質專一性的Ubl-specific peptidase-160 (CrULP-160) 則有待進一步的研究。 關鍵字：泛素、SUMO、NEDD8、類泛素蛋白質胜肽酶、SENP、CrBi-Ub
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自體免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）是一種慢性肝炎，好發於年輕女性，且可能進展為肝硬化。罹患自體免疫性肝炎時，患者的免疫系統會以肝臟細胞為攻擊對象，持續地破壞肝臟。目前對於造成自體免疫性肝炎的機制尚不清楚，本研究以 Con A 建立自體免疫肝炎的模式，探討 tumor necrosis factor-α (TNF-α)及 IL-1 (interleukin-1) 在自體免疫性肝炎扮演的機制。本研究結果發現，在TNF-α-/-、TNFR1-/- 及 IL-1R-/- 小鼠，嗜中性球進入肝組織的情形會減少，並且肝受損指數 ALT 有顯著下降。因此結果顯示，Con A 造成小鼠的肝損傷會透過TNF-α及 IL-1 的參與，吸引嗜中性球進入肝組織，造成肝組織受損。在本研究也發現在 TNF-α-/-及 TNFR1-/- 小鼠，CD4+ T 細胞浸潤肝臟組織會減少。因此 Con A 會透過 TNF-α 的參與，誘發 CD4+ T 細胞浸潤肝臟組織，進而造成肝臟的損傷。 酒精性肝炎引起的病理特徵有脂肪肝、發炎及肝細胞壞死。但對於酒精如何 引起肝臟受損的機制並不清楚。因此本研究建立急性酒精性肝炎的模式，探討其 可能的機制。研究中發現，在TNFR1 缺陷小鼠中，嗜中性球浸潤肝臟組織的情形 會減少，且肝受損指數 ALT 及 AST 有顯著下降。本研究的結果證實在酒精誘發 的急性肝損傷模式中 TNFα-TNFR1 之作用途徑參與嗜中性球浸潤肝臟組織，以及 造成肝組織受損情形。
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在發炎反應中，組織中的巨噬細胞常負責辨識外來病原菌或物質，活化後能夠釋出發炎相關細胞激素 (cytokine) 進一步引起發炎反應。本篇研究中，我們首先研究 C5aR (C5a receptor) 在受損細胞引起腹膜炎的無菌發炎模式中扮演的角色。結果顯示 C5aR 缺陷小鼠，腹腔中嗜中性白血球滲入 (neutrophil infiltration) 的情形與野生型小鼠 (wild-type) 無異。接著我們以包覆 clodronate 的微脂體 (liposome) 去除小鼠腹腔中巨噬細胞，觀察巨噬細胞是否參與在受損細胞引起小鼠的腹膜炎中。結果顯示，將受損細胞以腹腔注射引起小鼠腹膜炎後，去除腹腔中巨噬細胞的小鼠其腹腔中嗜中性白血球聚集的情形有顯著降低。 另外，我們也利用 AAP (acetaminophen) 造成的肝臟細胞壞死，作為體內組織受損模式，來研究 TNF-α 在受損細胞引起發炎反應中扮演的角色。在這個體內組織受損模式中，TNFR1 (TNF-α receptor 1) 缺陷小鼠中以腹腔注射給予過量 AAP 後，不管是血清中肝功能指數 (ALT activity)、嗜中性球聚集情形、及發炎相關細胞激素的釋放 (TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, and KC) 的情形都有顯著降低。而 TNF-α 缺陷小鼠對於 AAP 引起的肝細胞壞死及發炎反應也都有明顯的保護效果。在注射入 AAP 的前一天，若給予小鼠阻斷 TNF-α 訊息傳遞的藥物 “ Enbrel ”，則能有效降低 AAP 引起的肝細胞壞死及其引起的發炎反應。由以上結果可知，TNF-α 參與在由 AAP 引起的肝臟損傷中。而阻斷 TNF-α 的訊息傳遞可能成為有效治療 AAP 引起肝細胞受損的策略。
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為降低 Pichia pastoris 胞外蛋白酶在生產時對重組塵蟎過敏原蛋白的降解，以使用歐洲塵蟎重組過敏原蛋白質進行過敏源專一性的口服耐受性免疫試驗，本研究將先前本實驗室已建構完成含有 Der p 1＊-Linker- Der p 2 基因之 pPICzαA 載體，電轉形進入蛋白酶缺陷株 P. pastoris SMD1168，並利用對 Der p 2 專一性之三明治酵素連結免疫分析法，挑選出表現量最高的轉形株。將重組 P. pastoris SMD1168和重組 X-33 (對照組) 在 Hinton 氏搖瓶中分別以 Base salt medium (BSM) 或 Buffered glycerol complex-medium (BMGY) 培養，並添加蛋白酶抑制劑: 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)、1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)，或是 1% 蛋白酶受質 casamino acid，在這些不同條件下比較。由蛋白酶活性測試可知，添加 1 mM PMSF 可抑制 22% 總蛋白酶活性，且以專一於 Der p 2 之西方點墨法結果可發現正確分子量的重組蛋白質，由以上實驗顯示添加蛋白酶抑制劑PMSF 及蛋白酶受質如 casamino acid 可有效減緩蛋白酶降解現象並偵測到正確分子量之蛋白質。在 Bioflo 110 生物反應器中以 BSM 培養並添加 1% casamino acid且自甲醇誘導後每天添加 0.1 mM PMSF，濕重最高可達 241.2 g/L，融合過敏原表現量於49 小時達54.5 μg/mL。將來可再送入含有合成組胺酸基因的載體至SMD1168並增加 PMSF 添加量，以期維持重組蛋白質之產量。
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金屬螯合素合成酶 (phytochelatin synthase, PCS) 之活性調控方式，可能經由轉譯後之修飾 (post-translational modification) 而非轉錄層次。以蛋白質磷酸化預測軟體分析阿拉伯芥PCS1序列，發現Thr49附近有很強烈的CK2磷酸化訊號。進一步以藍綠藻NsPCS立體構造為模版，建立AtPCS1的N端區域三級結構，發現Thr49在立體結構上非常靠近Arg183，因此推論Thr49可能藉由磷酸化與Arg183的正電基團產生離子鍵作用力，造成構型改變進而提升PCS的催化活性。由蛋白質定位點突變實驗，已證實PCS的活性確實以磷酸化及去磷酸化調控。本論文針對PCS和三種Thr49點突變株T49A、T49D、T49E進行酵素動力學分析，結果發現T49A的Kcat明顯下降為wild-type (WT) 的23%，T49D和T49E也分別只有WT的7.6% 和10.2%；另外，T49A的Km值是WT的69%，而T49D和T49E分別為WT的5.8倍和1.9倍。由此可知，當Thr49置換成酸性胺基酸後，對於PCS的基質結合力和催化效率都與動機之推測相反。PCS可能以可逆的磷酸化調控來改變酵素的構形，Thr49上的磷酸化能穩定活性區的立體結構，進而提升PCS的催化效率。此外，由於植物內的PCS表現量很少，為了純化出大量的內生性PCS，我們將AtPCS1在阿拉伯芥中過量表現，經由抗生素篩選、PCR、半定量RT-PCR及IPCR等分子檢測，得到穩定表現AtPCS1之T3代轉殖株，期望藉由提高植物內PCS蛋白質表現量，純化得內生性的PCS，以進而深入研究PCS之磷酸化在植株內的生理角色。
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澱粉磷解酶 (L-SP) 與D-enzyme都是參與澱粉代謝的重要酵素，一般認為L-SP與澱粉合成較為相關 (Tickle et al., 2009)，且L-SP經磷酸化後會改變與澱粉合成相關酵素SBEI與SBEIIb的結合能力，進而影響澱粉的生合成 (Tetlow et al., 2004b)；而推測D-enzyme主要是參與澱粉的降解過程 (Zeeman et al., 2010)。此外，研究發現大腸桿菌之D-enzyme (malQ) 與1,4-alpha-D-glucan phosphorylase (malP) 位於同一操作組上 (Goda et al., 1997)，說明了D-enzyme與SP可能同時有基因表現並共同作用。張世宗 (1999) 在純化蛋白質過程，發現L-SP高分子量活性色帶HX，後續林怡岑發現D-enzyme也有往高分子量位移的現象。另外，由免疫共沉澱結果推測L-SP與D-enzyme可能有交互作用的現象 (林怡岑, 尚未發表)。 本研究乃以L-SP與D-enzyme的交互作用為主軸，先以GST pull-down assay及Far Western確認L-SP與D-enzyme可互相結合，再利用native/SDS 2D-PAGE與膠體過濾法分析，發現HX之次單元體組成可能為四個L-SP及四個D-enzyme次單元體，整體分子量約686 kDa。此外，比較添加磷酸酶抑制劑或CIAP (calf intestine alkaline phosphatase) 對HX形成之影響，發現磷酸化修飾可促進L-SP與D-enzyme結合。酵素活性分析結果顯示，形成HX蛋白質複合體後，大幅提升了D-enzyme活性，且擴大可利用的受質範圍。推測HX作用模式可能先以D-enzyme與受質反應後，再將產物繼續給L-SP進行磷解反應。進一步在不同生長時期的甘藷塊根中，觀察到L-SP含量與甘藷塊根中澱粉的充實程度成正相關，顯示L-SP可能與澱粉合成途徑較為緊密相關；而D-enzyme則在甘藷塊根剛發芽時，其蛋白質的表現量與酵素活性都增加，顯示D-enzyme可能主要參與澱粉降解的途徑。有趣的是，HX則分別在甘藷塊根快速生長時期，與在甘藷塊根發芽後，都有較多的蛋白質量，推測在澱粉快速消長時，植物透過蛋白質後修飾或其他調控形成HX，協助回收可利用的葡聚醣，以利澱粉代謝的進行。
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紅麴發酵產物在亞洲應用於膳食已經有千年以上歷史。本研究以人類和小鼠大腸癌細胞株評估紅麴山藥酒精萃取物對大腸癌細胞之細胞增生、細胞轉移及細胞週期之影響。紅麴山藥酒萃物對大腸癌細胞HCT116、HT29、SW480、SW620與CT26皆有顯著的毒殺能力，對於CT26及SW480更可抑制其轉移作用，並透過抑制細胞週期停滯於sub-G1 phase，誘發大腸癌細胞走向細胞凋亡。此外，本研究利用誘導BALB/c小鼠產生腫瘤，分別建立全身性和局部性大腸癌動物模式，評估紅麴山藥對於大腸癌治療之功效。在局部性動物模式中，首先在小鼠後腿以皮下注射方式植入大腸癌細胞CT26，當腫瘤生長至150 ± 10 mm3 後，每天餵食不同濃度的紅麴山藥，並於四週後犧牲動物。全身性動物模式中，以脾臟注射的方式植入小鼠大腸癌細胞CT26，模擬臨床上大腸癌發生肝臟轉移的症狀，並於隔天摘除脾臟，同時開始每天餵食不同濃度紅麴山藥，持續四週，並分別在一到四週犧牲動物。研究結果顯示，不論是局部性或全身性之大腸癌動物模式，餵食紅麴山藥的實驗組其腫瘤嚴重程度都較控制組來的低，不但抑制腫瘤生長，更有抑制癌細胞轉移至其他器官的能力。因此，在大腸癌治療過程中，紅麴山藥具有相當潛力可以應用為一輔助治療劑。