臺灣大學微生物與生化學研究所學位論文
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本實驗利用切除卵巢鼠作為模擬停經後婦女的動物模式，分別利用不同劑量的山藥與紅麴山藥，及以大豆異黃酮做為正控制組分別餵食大鼠，觀察大鼠骨質的變化情況。Citrinin、monacolin K、monascin 及 ankaflavinc 的濃度分別為4.63 ppm、104.8 ppm、369 ppm、602.8 ppm。山藥及紅麴山藥不含異黃酮類及木質酚類植物雌激素，但皆含薯蕷皂苷配基 (diosgenin)，在紅麴山藥及山藥的含量分別為 1.36 mg/g 及 0.68 mg/g。進行手術前後利用微型電腦斷層儀 (microcomputed tomography, micro-CT) 及雙能量 X 射線吸收儀 (dual energy x-ray absorptiometry, DEXA) 測定骨質狀況，結果顯示手術前各組骨質無明顯的差異，手術三個月後即誘導出骨質疏鬆症。接下來餵食樣品四週後，由 micro-CT 影像定量結果可知，各組的骨質狀況相對於 OVX 組皆有改善，尤以餵食紅麴山藥組 I. RMD 2X、II. RMD 2X、II. RMD 2X 最為顯著。餵食大豆異黃酮組 (ISO) 之骨鹼性磷酸酶 (bone alkaline phosphatase, bone-ALP) 活性有較高的趨勢，而本實驗餵食的樣本 (山藥與紅麴山藥) 對於大鼠之活性無顯著的影響。由骨鈣素濃度測定結果可知，除了 I. dioscorea 1X 組之外，其餘各組之骨質合成作用相對於 OVX 組皆有改善。右股骨進行 micro-CT 3 D 影像分析結果中，觀察出試驗組各組與 OVX 組比較，骨質皆有正向的改善，尤以 ISO、I. RMD 2X、II. RMD 2X 三組改善最為顯著。右股骨遠端骨小樑定量的結果中，餵食異黃酮組與餵食兩倍劑量的紅麴山藥組，骨質相較於 OVX 組有改善的趨勢，其中骨小樑厚度之分析結果具有顯著差異。在肝、腎血清指標及染色切片的安全性評估中，除了因切除卵巢引起的脂肪堆積，造成少數輕微至中度脂肪肝的情況之外，其他指標與檢驗皆為正常。
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憂鬱症為主要最常見的神經失調疾病，包括心情及認知能力的改變，及經常有死亡或自殺念頭。現今臨床的治療藥物並不適用於所有患者且會產生副作用，因此尋找具抗憂鬱功效且低副作用的物質為極具價值性的研究方向。γ-胺基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 是一重要的神經傳導物質，且具有許多生理活性，如降血壓、利尿及改善焦慮、憂鬱等情緒相關疾病，在此研究中，利用紅麴探討在不同培養基質及培養條件 (培養時間、pH 值、溫度及接種量) 對 GABA 生成的影響；另一方面，利用強迫游泳動物試驗 (forced swimming test, FST) 評估富含 GABA 的紅麴發酵產物其抗憂鬱功效。利用反應曲面法探討 GABA 最適生成條件，當米糠添加比例為 77.3%、培養基起始 pH 值 6.3 及麩胺酸鈉濃度 122.6 mM 時，發酵 7 天後，GABA 從原本 40 mg/L 提升至 350 mg/L，每克 GABA 生產成本為新台幣 8.5 元。另一方面，在強迫游泳短期試驗顯示，GABA為紅麴發酵產物中主要具抗憂鬱功效之物質；而長期試驗中，紅麴發酵產物比同劑量之 GABA 具更好的抗憂鬱潛力，效果類似於 fluoxetine (臨床抗憂鬱藥劑)。於腦組之中，GABA 能提升杏仁核及海馬迴中正腎上腺素、多巴胺與血清素含量；除此之外，紅麴發酵產物更能減緩杏仁核及海馬迴多巴胺的消耗。因此，富含 GABA 之紅麴發酵產物具有低基質成本與抗憂鬱功效等市場潛力。
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紅麴發酵產物為深具東方特色之傳統食品，其二次代謝產物經科學研究證實具有抑制腫瘤轉移、抗發炎、降低膽固醇生成等多項作用。因此，在學理上十分適合運用於抑制腫瘤治療過程中可能引發的腫瘤轉移及組織發炎反應的輔助性治療。 本論文第一部份利用小鼠肺癌細胞 (Lewis lung carcinoma; LLC) 植入C57/BL6 小鼠所形成 LLC 荷瘤小鼠，探討給與紅麴米餵食所產生之效應。植入 5 x 105 LLC 細胞之小鼠，同時餵食 2% 紅麴米，經 14 天後與未攝食紅麴米組比較腫瘤大小，紅麴米抑制達 51.1% 之多。以紅麴乙醇萃出物 (red mold rice ethanol extract; RMRE) 進行體外侵襲與轉移試驗顯示，RMRE 可抑制透過介白質六號 (Interleukin-6; IL-6) 所活化，與侵襲及轉移能力增加相關的基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases; MMPs)，包括 MMP-2 與 MMP-9。進一步在 RMRE 合併臨床化療藥物治療的效力上發現，RMRE 不僅造成 LLC 細胞的細胞週期停止於 G1 期，同時隨著劑量提升而增加誘發其細胞凋亡現象。 第二部份探討 RMRE 抑制 LLC 荷瘤小鼠血清中血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor; VEGF) 上升，同時降低荷瘤小鼠轉移的發生。結果指出 RMRE 中的 monacolin K (MK) 可能扮演著關鍵性角色，包括利用體外轉移與血管新生試驗證實 MK 抑制 LLC 細胞的轉移侵襲能力，同時經反轉錄聚合酶鏈反應 (reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR) 得知，MK 藉由降解 VEGF 基因表現而抑制 LLC 細胞分泌 VEGF 誘發內皮細胞血管之生成。 第三部份以雞胚胎尿囊絨毛膜 (chorioallantoic membrane; CAM) 試驗探討 RMRE 與紅麴抗氧化物 dimerumic acid (DMA) 對於腫瘤血管新生與細胞內滲之作用。RMRE 與 DMA 隨著劑量與時間增加對人類大腸癌細胞株，SW480 與 SW620 細胞，具有劑量關係。同時經由分析雞胚 CAM 下方所含有人類 Alu 序列片段結果顯示，RMRE 可抑制於 Matrigel 包覆有 SW620 細胞之植體從雞胚 CAM 上方自發性內滲轉移至 CAM 下方的能力。含 SW620 細胞之植體於 CAM 中可增加 75.3±11.6% 之新生血管生成，然 RMRE 可隨劑量增加而顯著抑制 SW620 所誘發之 CAM 血管新生。最後經由 RT-PCR、西方墨點轉漬分析與酪蛋白酶譜分析顯示 RMRE 藉由抑制 MMP-7 活性達到降低腫瘤轉移發生。 以上顯示，利用 LLC 荷瘤小鼠或雞胚胎 CAM 等動物模式皆證實以膳食補充紅麴米方式可達到抑制腫瘤生長與轉移之發生。因此，包括 RMRE、MK、AK 與 DMA 於未來相當具潛力研究發展，使成為一無毒性、天然之化學預防膳食補充品，或作為癌症治療輔助劑。
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植物細胞可利用植物螯合素 (phytochelatin; PC) 與環境中的重金屬結合，PC是由經植物螯合素合成酶 (phytochelatin synthase; PCS, EC 2.3.2.15) 催化而成。前人研究指出 PCS 的胺基酸序列中，至少有六個重要位置與其催化活性有關；而根據不同物種間 PCS 的胺基酸序列比對結果，其中 Y55 必定為Tyr 或 Phe，呈現半保守性。本研究主要探討阿拉伯芥 AtPCS1 中 Y55 在催化機制中所扮演的角色；我們利用一系列 Y55 突變株 (Y55A, Y55D, Y55E, Y55H, Y55F 與 Y55W) 進行 PCS 之活性分析，結果發現此一系列突變株之活性皆有不同程度的下降。其中突變株 Y55D, Y55E 皆無活性，Y55A 活性僅剩 10%。根據芳香環之陽離子 -p 電子交互作用假說，具有芳香環結構的 Tyr 與 Phe 可能提供陽離子 -p 電子交互作用，以促成正常催化能力，因此當 Tyr 突變成其他性質的胺基酸後，陽離子 -p 電子交互作用無法形成，導致 PCS 活性下降。 本論文並利用洋蔥表皮細胞表現 AtPCS1-sGFP 融合蛋白，利用螢光顯微鏡觀察AtPCS1-sGFP 之細胞定位，結果發現 AtPCS1-sGFP 主要表現在細胞質中，推測可能細胞質中的受質 GSH 有關。
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苯丙胺酸脫氨裂解酶 (Phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC 4.3.1.5 or 4.3.1.24) 催化苯丙胺酸 (phenylalanine) 非氧化型脫氨反應產生肉桂酸 (trans-cinnamic acid)，是植物 phenylpropanoids 生合成的第一個關鍵酵素。許多植物二級代謝產物為 phenylpropanoids 衍生物，如黃酮素 (flavonoids)、花青素 (anthocyanins)、植物荷爾蒙、木質素 (lignin) 與植物殺菌素 (phytoalexins) 等。 綠竹 PAL 研究以竹殼蛋白質純化與基因選殖等方法進行。以 Q-TOF 質譜法鑑定純化的 PAL 之胺酸序列。篩選綠竹 cDNA 庫得到兩條 PAL 基因，命名為 BoPAL1 與 BoPAL2，ORF 分別為 2,139 bp 與 2,142 bp，彼此有 91% 核苷酸相似度與 96% 胺酸相似度。從綠竹 cDNA 中以 PCR 方法分離出全長 BoPAL3 與 BoPAL4 及不完整之 BoPAL5 基因。BoPAL2、BoPAL3 與 BoPAL4 皆由一個 intron 與兩個 exons 組成，但 BoPAL1 沒有 intron 存在。綠竹 PAL 胺酸具有保守性之活性區序列，Ala-Ser-Gly 三個胺酸會自體催化成 3,5-dihydro-5-methylidine-H-imidazol-4-one (MIO) 輔基。BoPALs 基因表現在 Escherichia coli 與 Pichia pastories 中，BoPAL1 與 BoPAL2 都以同質四元體存在，且可以偵測到 PAL 活性，重組蛋白質生化性質與原態竹殼 PAL 類似。大腸桿菌表現之 BoPAL2 重組蛋白質作為免疫小白鼠的抗原，製備之抗體可以專一性辨識原態與重組 PAL 蛋白質，使用 anti-PAL 抗體進行免疫組織化學研究。綠竹維管束組織 (vascular bundle) 中 PAL 主要定位於厚壁細胞 (sclerenchyma cells) 內，PAL 會參與木質素的生合成，與維管束組織發育相關。以 TAIL-PCR 成功選殖 BoPALs 基因的 5’-端上游區域，帶有可能之 TATA box 與數個 MRE (MYB recognition elements)。
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AtMAPRs 家族蛋白質包含 AtMAPR2、AtMAPR3、AtMAPR4 和 AtMAPR5。在 E1、E2、ATP 和泛素的環境中，GST-AtMAPR3 和 GST-AtMAPR5 的重組蛋白質可接上泛素 (林盈涵, 2009)。由於以上的實驗中沒有作 GST 的負控制組，因此以胞外泛素化修飾實驗分析 GST。經由免疫染色分析發現，GST (26 kD) 上方有一分子量上升之色帶 (35 kD)，此結果可推論GST 可能具有自身泛素化活性。進一步利用 pull down assay 分析 GST 與泛素可能之交互作用，並利用軟體模擬 GST 與泛素交互作用之模式。此外，利用胞外泛素化修飾實驗，分析不同長度之 His-AtMAPR3 (AtMAPR3, AtMAPR3ΔTM 和 AtMAPR3ΔTMΔC) 和 His-AtMAPR5 (AtMAPR5ΔTM 和 AtMAPR5ΔTMΔC)的自身泛素化活性，其中只有 His6-AtMAPR5ΔTM (70-220 a.a.) 觀察到可能具有胞外自身單一泛素化活性。GST是否會影響 His6-AtMAPR5ΔTM (70-220 a.a.) 的自身泛素化活性，還待進一步的實驗驗證。
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過去微生物學家認為Haloarcula marismortui 不會泳動，然而近年的研究證明了H. marismortui 鞭毛的存在，顯示其具有泳動能力。本研究觀察H. marismortui 的活菌泳動現象，並以ImageJ 追蹤其泳動軌跡 (swimming trajectory)。由於其軌跡相當雜噪 (noisy)，因此難以適用於前人所建立的泳動分析演算法 (motion analysis algorithm)。在此我提出 “window vector” 的概念，以Microscope Excel-VBA 程式語言建立一個微生物泳動分析演算法 (microbial motion analysis algorithm)，具有以下功能：(1) 不需以實驗結果個別化估算分析參數 (empirical parameter customization)，而用冪次率關係 (power-law relationship) 自動分辨細胞為泳動或非泳動；(2) 減低布朗運動對泳動軌跡造成的雜訊 (noise)，因此提升泳動折返 (swim reversal) 判斷的準確性。藉此演算法，本研究證明了HmSRI 和HmSRII 這兩個近來被確認的感光視紫質 (sensory rhodopsin) 的生理功能，分別是趨光性 (photoattractant) 和避光性 (photorepellent) 反應。H. marismortui 是除了 Halobacterium salinarum 外，唯一被確認具有光趨性 (phototaxis) 的古生菌。
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過去研究指出聚合度4-7 的N-乙醯幾丁寡醣 (N-acetylchitooligosacharides) (GlcNAc) 4-7具有抗腫瘤、提高小鼠免疫能力的生物活性。本研究由富含幾丁質環境中篩選出具有可分解幾丁質產生較高聚合度的N-乙醯幾丁寡醣的菌株。初期篩選中，先以幾丁質作為培養基主要碳源，篩選可利用幾丁質之微生物，再以粗酵素液水解膠態幾丁質，以 HPLC 與 TLC鑑定其產物是否具有 (GlcNAc) 4-7。經由此篩選程序，選獲一菌株可水解幾丁質產生(GlcNAc) 4-5，水解幾丁聚醣產生(GlcN/GlcNAc) 4-6 。此菌株經16S rDNA 分析，被分類與 Aeromonas caviae 之親緣關係最為接近，本研究中命名為 Aeromonas caviae No. 2 。探討此菌株的最佳培養條件，以增加幾丁質酶之生產方面，首先以不同之培養酸鹼值與溫度測試，獲得最佳培養酸鹼值為pH 6 , 溫度為25℃。另以反應曲面法 (response surface methology, RSM) 之中心混成設計 (central composite design, CCD) 得到最佳酵素生產培養基條件之碳源與氮源濃度為colloidal chitin 1.098% , soybean flour 0.735% 和 yeast extract 0.74%。以複選培養基培養之粗酵素液以一系列純化方法包括：硫酸銨分劃 (40-70%) ，專一性吸附水解法及 Sephacryl 200 膠體過濾進行純化。純化後在SDS-PAGE於 55 至 100 kDa之間得到四個可能和分解幾丁質相關的蛋白質，其中有兩個於 55-70 kDa 間於幾丁質活性染色膠體電泳中具有活性訊號。但是若以最佳化培養基培養之粗酵素液純化過後之蛋白質在 SDS-PAGE 上於 40 至 100 kDa 之間分佈 9 個蛋白質訊號，活性染色上則可測得三種幾丁質酶，其中兩種於 55 至 70 kDa 附近，而在40 kDa 附近也有一條活性訊號。另在純化後之蛋白質水解產物方面，其水解幾丁質產生大量之 (GlcNAc)2 與少量 GlcNAc 和 (GlcNAc)3，另水解幾丁聚醣之產物亦出現 (GlcNAc)4-6 以及可能為更高聚合度之寡醣。
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中文摘要 細胞骨架重組在細胞移動、細胞分裂、吞噬作用與形態發生的過程中扮演一相當重要的角色。在許多不同的細胞型態中，Rho family GTPases 的成員是主要調控細胞骨架，而Rnd1為Rho family GTPases 新的成員之一。五-氨基酮戊酸光動力效應 (ALA-PDT) 為一新興癌症治療方式，其作用為能夠選擇性地作用於粒線體產生單態氧與活性氧分子，因而導致細胞的死亡。在本研究中我們利用五-氨基酮戊酸光動力效應做為一可特定造成粒線體傷害的工具，並採用老鼠嗜鉻細胞瘤 (Rat Pheochromocytoma cells, PC12 cells) 做為類似神經細胞之模式細胞株，探討 Rnd1 在 ALA-PDT 抑制 PC12 細胞神經軸突延長的角色。 我們發現，利用Rnd1 siRNA 降低粒腺體功能缺失的 PC12 變異株細胞 Rnd1 表現，當存在有神經生長因子（nerve growth factor）的狀況下，細胞軸突外生現象減少並且可以正常延展。在其他相關訊息調控因子中，以ALA-PDT處理後，我們發現細胞內ROS與Rnd1 表現量增加，同時觀察到MAPKs與AMPK均被活化，抑制細胞內JNK, ERK 與 AMPK後Rnd1表現量減少，而抑制p38分子活性則對Rnd1無明顯影響。
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光作為地球上重要的能量來源，其對於生物體的訊息傳遞與生理調控也扮演重要角色。在嗜鹽古細菌 (halophiles) 細胞膜上一般具有四種光感蛋白質，分別是感光型視紫質第一型與第二型 (sensory rhodopsin I,II)，功能為進行訊息傳遞。與細菌視紫紅質 (bacteriorhodopsin, BR)，功能為氫離子幫浦；及氯視紫質 (halorhodopsin, HR)。其中氯視紫質普遍存在於嗜鹽古細菌中，可接收黃光激發而將氯離子往內運輸。藉由在胞內累積氯離子，可使嗜鹽細菌在生長時持續維持滲透壓平衡；此外由於胞內氯離子的增加，造成膜內側負電荷累積，間接增強向內質子動力 (inward proton motive force) 因而使能量的產生更有效率。此外，由於細菌視紫紅質和氯視紫質皆為離子幫浦且兩者在序列上有一定相似性，過去研究曾成功利用突變特定胺基酸 (HsBR 中 D83T與D83S) 而使細菌視紫紅質轉變成一向內傳輸之氯離子幫浦。相反地，若要將氯視紫質變為向外運輸氫離子幫浦，目前所知只能由外加疊氮化物 (azide) 達成。 目前發現的兩種氯視紫質，分別來自Halobacterium salinarum (HsHR) 與Natronomonas pharaonis (NpHR)，其生化特性與光週期已有深入研究，蛋白質結構也都成功解出。本研究新鑑定出兩種氯視紫質，分別來自另兩株嗜鹽古細菌Haloarcula marismortui (HmHR) 和 Haloquadratum walsbyi (HwHR)。將這兩種氯視紫質異源表現純化，可見光光譜掃描顯示其最大特徵吸收峰落在576 nm及573 nm，和NpHR及HsHR非常相近。功能性檢測方面，也以被動氫離子傳輸實驗 (passive proton transport) 證實兩者同為氯離子幫浦。生化特性部分，在氯離子親和性分析實驗及鹼滴定實驗中，所得氯離子解離常數與 pKa 均與前人研究類似。由以上結果整合，相較於其他存在於微生物中之光驅動離子傳輸視紫紅質，氯視紫紅質蛋白質在各方面居有高保守性質，也說明了此類蛋白質對於嗜鹽古生菌的重要性。 另一方面，過去研究顯示沒有任何關於以突變方法，將氯離子幫浦轉換為向外氫離子幫浦的研究；本篇研究嘗試以 HwHR 為例，根據序列比對結果設計三個突變位 (七種突變組合) 將 HwHR 相對應 HsBR 的重要胺基酸依序突變成 HsBR 上所具有的序列；此外，也一同檢驗 D85T 與 D85S 突變是否能在 Haloarcula marismortui 細菌視紫紅質中得到相同效應。經過蛋白質表現、純化及生理測試，HmBRI D83S 突變蛋白質具有被動氫離子傳輸活性，HmBRI D83T 突變蛋白質則轉換為向內氫離子傳輸蛋白質。然而，所有HwHR突變蛋白質皆未觀察到功能上的變化，甚至數個突變蛋白質皆成為 apoprotein 或在異源表現上遭遇困難。造成此現象的原因可能為引入之突變胺基酸使視黃醛分子無法順利與蛋白質結合，也顯示了細菌視紫紅質在演化過程中應早於氯視紫質，因而這些重要胺基酸的改變於功能上無法逆轉。