• 學位論文

以小鼠化學致癌發炎模式探討米食對大腸直腸腫瘤發生之影響

台灣近二十年來飲食西化，癌症等慢性疾病成為主要死因，癌症中大腸直腸癌發生率快速升高，已成為發生人數最多的癌症。大腸直腸癌的發生與預防與飲食相關性密切，理論上飲食的改變可以降低45％的發生率，目前主要的保健飲食建議是以全榖類主食取代精緻榖類。稻米是國人的主食，具有悠久的食用歷史。已知稻米中含有許多抗氧化與抗發炎物質，這些物質大量存在糠層與胚芽中，因此適當應用米糠和糙米的組合具有抑制大腸直腸腫瘤產生之潛力。本研究採用合併給予化學致癌劑AOM（Azoxymethane）與發炎劑DSS（Dextran Sodium Sulfate）誘發大腸直腸腫瘤的動物模式，探討Chow diet、白米(white rice)與米糠加糙米(brown rice enriched with bran)對大腸直腸腫瘤的預防效果，並且評估其細胞與分子機制。實驗動物採用國家動物中心之近親品系小鼠C57BL/6JNarl，依飼料組成分為五組：AIN-93G組（93G）、高蛋白質AIN-93G（M93G）、Chow diet組（Chow）、高蛋白質白米組（WR）與高蛋白質米糠加糙米組（RB）。並於七週齡與十週齡當體重達23 g時，注射AOM開始誘發大腸直腸腫瘤的實驗，實驗期間定期秤量體重，紀錄腸道出血症狀。七週齡致癌組於實驗第100天犧牲，十週齡致癌組於實驗第88天犧牲。針對大腸組織的分析項目包括：長度、病理評分、腺瘤數目與分布、組織免疫染色，染色分子包括細胞增生指標蛋白質Ki-67，Wnt訊號路徑分子β-catenin，發炎指標Cyclooxygenase-2（COX-2）與誘導型nitric oxide synthase（iNOS），以及大腸癌幹細胞標記分子CD133。七週齡致癌組之實驗結果顯示，大腸長度只有Chow組顯著性長於其餘四組；病理評分各組間無差異；Chow diet與RB組較93G組的大腸腺瘤數目顯著較少，WR組則有較低之趨勢；大腸腺瘤組織與正常黏膜組織Ki-67的表現量以Chow與RB組顯著低於93G組；腺瘤組織的COX-2表現量以Chow與RB組顯著性低於M93G組；腺瘤組織的CD133表現量以Chow、WR與RB組顯著低於93G與M93G組。十週齡致癌組之實驗結果顯示，各組均未發生腫瘤，但是大腸長度以Chow與RB組顯著長於其餘三組；大腸病理評分以Chow與RB組顯著低於M93G組；正常大腸黏膜組織的Ki-67表現量以Chow與RB組顯著低於其餘三組。綜合實驗結果可知，Chow diet與米糠加糙米組可在腫瘤發生前顯著減少Ki-67表現量，表示減緩大腸的增生速率；於腫瘤發生時，顯著減少腺瘤數目、Ki-67表現量、COX-2表現量，並且降低大腸癌幹細胞分子標記CD133的表現量，具有延緩大腸細胞增生能力，顯示全穀類米食具有腸道保健之效益，有助於大腸直腸癌之防治。

• 學位論文

山苦瓜與共軛次亞麻油酸對氣喘模式小鼠發炎與過敏免疫反應的影響

已有研究指出山苦瓜的降血糖功效與其乙酸乙酯萃物含共軛次亞麻油酸 (9c, 11t, 13t-conjugated linolenic acid, CLN)活性成份，但對於免疫調節的影響，尚未有研究發表。本研究首先以細胞培養探討花蓮四號山苦瓜正己烷(BGP-Hex)、乙酸乙酯(BGP-EA)、酒精(BGP-EtOH)與水萃物(BGP-H2O)和CLN，對巨噬細胞株RAW264.7、小鼠T細胞株EL4、小鼠初代細胞分泌細胞激素的作用。結果發現BGP-EA、BGP-Hex和BGP-EtOH能顯著的降低RAW264.7的TNFα及IL-6分泌，也顯著的抑制初代腹腔細胞IL-6的分泌。CLN能降低初代腹腔細胞TNFα及IL-6的分泌，也能顯著減少小鼠初代脾臟細胞IFNγ與IL-4。在體外實驗初步觀察到山苦瓜萃物與CLN具有抗發炎的潛力及調節免疫的效果。本研究接續探討山苦瓜與所含的CLN對氣喘模式小鼠發炎與過敏免疫反應的影響，將 BALB/c 小鼠8週大時以卵蛋白（ovalbumin, OVA）加佐劑氫氧化鋁，隔週腹腔致敏以誘發過敏免疫傾向。三次致敏之後，將以小鼠分為五組，分別為OVA-oil控制組 、飼料含5%山苦瓜凍乾粉的OVA-BGP組、每天管餵35 mg共軛次亞麻油酸OVA-CLN組、每天管餵35 mg共軛亞麻油酸 (conjugated linoleic acid, CLA) 的OVA-CLA組、和固醇類藥物prednisolone正對照OVA-Pred組 ，另有一組為未致敏的PBS-oil組。餵食期間以5%霧化之OVA給予致敏小鼠呼吸道刺激，誘發過敏性呼吸道發炎，而PBS-oil組給予霧化PBS。小鼠餵食13天後，以methacholine (Mch)刺激呼吸道，測定呼吸道過度反應(airway hyperresponsiveness, AHR)時的呼吸阻力。小鼠餵食16天後犧牲，採血液、肺氣管沖洗液、分離脾臟及腹腔細胞、取肺組織進行切片觀察與抽取RNA分析基因表現。結果顯示，OVA-BGP組與OVA-CLN組在Mch各濃度下呼吸道阻力係數Penh值顯著低於OVA-oil控制組，OVA-CLA組在大於25 mg/mL Mch刺激下也顯著較低，表示山苦瓜、CLN和CLA可減緩過敏性氣喘。與OVA-oil控制組相較， OVA-BGP組顯著減少肺氣管沖洗液中的總細胞、嗜伊紅性白血球及嗜中性白血球的數目、也降低Th2細胞激素IL-4、IL-5、IL-13與促發炎介質IL-6、PGE2和eotaxin含量，肺組織中的COX-2 mRNA表現也顯著較低，且顯著的回復肺組織中的PPARα基因表現量，顯示山苦瓜抑制發炎反應與Th2免疫反應。並且，OVA-BGP組的脾臟細胞在ConA刺激之下，IFN-γ分泌量顯著高於OVA-oil組，在特異性OVA刺激下的脾臟細胞IL-13分泌量顯著較低，血清總IgE生成量也顯著較低，顯示山苦瓜對調節傾免疫向Th1反應。 OVA-CLN組則是顯著降低肺氣管沖洗液中嗜伊紅性白血球的數目和IL-5含量，回復肺組織PPARγ mRNA的表現量，顯示CLN的抗發炎作用。而OVA-CLA組顯著降低脾臟細胞在ConA刺激之下IL-13的分泌，肺組織IL-12與PPARα mRNA表現量也顯著較高，故也測得顯著低的血清總IgE生成量，顯示CLA具調節免疫傾向Th1的作用。因此，由誘發致敏小鼠產生過敏性氣喘的動物模式顯示，山苦瓜具抑制過敏的免疫調節與抗發炎作用，所含成份的CLN則以降低呼吸道發炎作用較顯著，山苦瓜能減少過敏性抗體IgE的生成，應有助於減緩過敏免疫反應，值得推廣。

• 學位論文

紅麴二次代謝物 monascin 與 ankaflavin 對 3T3-L1脂肪細胞新生作用與脂解作用之探討

本研究利用3T3-L1前脂肪細胞株探討紅麴二次代謝產物黃色素中的 monascin (MS) 與 ankaflavin (AK) 對於前脂肪細胞增生、脂肪新生之影響與分化路徑之探討，並分析成熟脂肪細胞脂解作用與脂蛋白脂解酶活性變化。結果顯示， MS 與 AK具有抑制前脂肪細胞增生之效果並呈劑量效應，處理濃度為 8 μg/mL 作用 48 hr 後，MS 與 AK 的抑制率分別為 80.5%、69.2%。在抑制分化之效果上，以 0.125 μg/mL MS處理後抑制三酸甘油酯 (triglyceride, TG) 累積達 37.1%，0.125 μg/mL AK 抑制率為 41.1%，抑制分化效果並無明顯劑量效應。分化路徑分別以轉錄、轉譯層次探討；轉錄層次以即時定量聚合酶鏈反應 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 分析之， MS 與 AK 於分化前期、中期皆可抑制CCAAT/enhancer-binding protein β (C/EBPβ)、C/EBPδ、peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) 和 C/EBPα 之基因層次表現；後期 MS 與 AK 對PPARγ、C/EBPα 基因之表現影響並無統計上之差異。轉譯層次以西方點墨法分析，MS 與 AK 皆可抑制 C/EBPβ、PPARγ 與 C/EBPα 之蛋白質表現，且呈劑量效應，以 2 μg/mL MS 及 AK 處理六天後抑制率分別為 43.3%、33.7%、48.5% 及 76.1%、43.5%、63.3%。脂解作用方面，MS 與 AK 均可刺激成熟脂肪細胞釋放甘油，以 4 μg/mL MS及 AK 處理後釋放甘油比例分別增加 113.2%、278.3%，且能抑制脂肪細胞肝素釋放脂蛋白脂解酶 (heparin-releasable lipoprotein lipase, HR-LPL)，以 4 μg/mL MS及 AK 處理後抑制率分別為45.3%、58.1%。本研究證實紅麴二次代謝物除了monacolin K之外的活性物質黃色素 monascin及ankaflavin能夠抑制前脂肪細胞分化，並刺激成熟脂肪細胞進行脂解作用，減少胞內脂肪的累積。

• 學位論文

草蝦Kruppel-Like Factor蛋白質的功能性分析

Sp1-like蛋白質和Kruppel-like factors (KLFs)均具有高相關性的鋅指 (zinc finger)區域，在細胞轉錄過程中扮演重要角色。利用NCBI資料庫比對發現一個草蝦 (Penaeus monodon)的表現序列標誌 (EST, HPA-N-S01-EST0038)和Sp1序列具有高度同源性。因此本研究利用5’端cDNA快速放大法 (5’RACE)成功地選殖出草蝦的KLF，並命名為PmKLF。PmKLF全長可轉譯出498個胺基酸。序列分析發現PmKLF和人類，老鼠及斑馬魚的KLF11相似。另外，演化分析此鋅指DNA結合區域在不同物種間具有高度相同性。利用RT-PCR分析PmKLF mRNA發現在蝦的中腸、肌肉、心臟、神經、鰓、肝胰腺和胃中均會表現。利用大腸桿菌重組蛋白質當作抗PmKLF蛋白質的抗原並生產抗PmKLF抗體得知PmKLF在草蝦中大小約為60 kDa。利用螢光顯微鏡觀察發現當過度表現PmKLF於昆蟲細胞Sf9時，PmKLF以點狀聚集在細胞核。另外，以PmKLF的刪除突變株分析發現PmKLF的鋅指區域含有進核訊號。而在未感染白點症病毒 (White spot syndrome virus, WSSV)及感染病毒的白蝦中，在其血球細胞中也觀察到PmKLF在細胞核內聚集成點狀。由於WSSV的極早期基因ie1在昆蟲細胞Sf9具有高度轉錄活性，將PmKLF的突變株及報導基因pIE1-Luc共同轉染入Sf9中，發現PmKLF的第166到381個胺基酸可能會影響ie1的轉錄。最後，在蝦體中以siRNA抑制PmKLF的表現後，再感染WSSV病毒，發現可以延長蝦的存活時間。綜合以上的結果，本研究首先分離出蝦的第一個KLF，並證實PmKLF在蝦被WSSV感染時可能扮演重要的角色。

• 學位論文

紅麴菌株鑑定及其發酵產物對於改善糖尿病病情之研究

利用本研究室分離出來的 Monascus purpureus NTU 568 發酵所得之紅麴發酵產物，具有多種保健功效，包括降血脂、抗疲勞、抑制類澱粉蛋白沉積、預防肥胖及抑制腫瘤細胞轉移。藉由形態觀察 (子囊孢子大小、培養基上生長菌落大小) 以及核醣體 RNA 基因 (ITS1、ITS2、5.8S、18S rRNA) 序列之分子生物學鑑定，鑑別本實驗室所分離之紅麴菌株 NTU 568 是否為 M. purpureus 之物種，並與其他相關菌株 (M. ruber、M. pilosus) 進行形態觀察及序列比對與鑑別。實驗結果顯示本實驗室所分離菌株 NTU 568 與食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心之菌株 BCRC 31615- M. purpureus 就形態及基因序列極為相似，應屬同種之相似菌株。本研究以 NTU 568 菌株進行相關研究。 本研究乃以不同基質 (米、山藥及薏仁) 發酵之紅麴產物，提高代謝產物為目標，採用體內動物評估模式，探討紅麴發酵產物對改善糖尿病病情之作用機轉。本研究發現，餵食 8 週 M. purpureus NTU 568 紅麴發酵產物 (200 mg/kg bw) 對於 STZ 誘導之糖尿病動物具改善效果，其可降低 STZ 老鼠之空腹血糖並改善葡萄糖耐受能力，且可顯著降低尿液中葡萄糖與蛋白質含量及減少血液中膽固醇及三酸甘油酯濃度，顯示紅麴對糖尿病症狀具改善效應。許多研究發現氧化壓力與糖尿病有相關性，而餵食 8 週 M. purpureus NTU 568 紅麴發酵產物後，可降低活性氧生成，且可提升胰臟抗氧化酵素活性，包括 CAT、GR、GPx 及 SOD，這些結果顯示，紅麴發酵產物可預防氧化壓力對 STZ 老鼠之胰臟所造成的氧化性損傷，以達保護效應，且該預防效應以紅麴山藥效果為最佳。 糖尿病之併發症大多伴隨體內氧化壓力之上升及發炎因子之增加，氧化壓力與發炎反應對於組織產生胰島素抗性扮演重要角色，因山藥與紅麴皆富含抗氧化組成，故本研究進一步探討紅麴山藥改善 STZ 誘發氧化傷害及發炎現象之改善效應。結果發現，STZ 老鼠經餵食紅麴山藥 6 週後除可降低血糖、膽固醇及游離脂肪酸含量，也可有效抑制發炎因子 IL-6、IL-1β 及 TNF-α 生成。綜合以上結果可知，利用菌株 M. purpureus NTU 568發酵之產物除可調節血糖外，更可藉由提升抗氧化活性而對胰臟具保護效果，抑制發炎因子生成而減緩 STZ 對胰臟所造成之傷害，顯示紅麴可開發為預防糖尿病之天然保健食材。

• 學位論文

以嗜甲醇酵母菌表現靈芝屬免疫調節蛋白質LZ-8、GMI和GFO-1並探討其免疫功能

由靈芝 (Ganoderma lucidum) 分離的免疫調節蛋白質LZ-8已證實具有多種免疫調節功能如促進淋巴球增生及抑制全身性過敏反應。本實驗室於2005年以genome walking方式由小孢子靈芝 (G. microsporum) 及拱狀靈芝 (G. fornicatum)釣取到LZ-8相似基因gmi、gfo-1及gfo-2 。之後發現GMI及GFO-1可刺激BALB/c小鼠骨髓樹突細胞分泌IL-12、刺激小鼠巨噬細胞株J774A-1分泌TNF-α以及刺激人類淋巴癌T細胞株Jurkat分泌IL-2。 　　由於前人研究多以細胞株進行免疫調節活性測試，測定的細胞激素種類也較少。故本研究欲以嗜甲醇酵母菌表現LZ-8、GMI、GFO-1及GFO-2，並以小鼠初代細胞探討其免疫調節功能，作為往後進行動物實驗之參考。 　　研究結果顯示，以搖瓶培養並經五倍濃縮，在誘導前菌體細胞濃度可達1.44 ± 0.03 × 1010 cfu/mL (rLZ-8 / H. polymorpha)、2.94 ± 0.23 × 109 cfu/mL (rGMI / P. pastoris) 及8.60 ± 0.14 × 109 cfu/mL (rGFO-1 / H. polymorpha)。以1%甲醇誘導1天後再濃縮純化，可得到23.3 ± 0.1 mg/L rLZ-8、4.3 ± 0.4 mg/L rGMI及8.5 ± 0.2 mg/L rGFO-1。在免疫調節活性部分，rLZ-8、rGMI及rGFO-1均可在未以其他物質刺激的條件下活化免疫系統，亦可刺激小鼠腹腔細胞及脾臟細胞產生細胞激素，具有抑制過敏反應及抑制腫瘤的潛力。與 rLZ-8及rGFO-1相比，rGMI在刺激IL-1β、IL-2、 IFN-γ、IL-4及IL-5的效果有明顯差異，可能與N端的α helix以及前35個胺基酸序列的差異性有關，未來可以點突變探討胺基酸序列的差異對上述細胞激素表現的影響。rGFO-2無法以嗜甲醇酵母菌順利表現，可能因本身基因序列具有高GC比例，密碼子使用率，或是與第60個胺基酸附近的loop序列有關，未來可設計引子修改密碼子，或針對loop的glycine進行點突變。

• 學位論文

利用最佳化啟動子提升農桿菌媒介之金針菇表現系統蛋白質產量

隨著異源基因表現系統的多元發展，分子農場的概念近年來快速發展，廣泛的用於醫藥用蛋白質或是其他特用產品的生產。食用性的作物也可應用在口服疫苗 (edible vaccine) 的開發。其中的關鍵技術包括宿主的選擇、基因的表現策略，基因穩定性、表現量的提升以及免疫效力等。本研究選用市場普及可工業化生產的金針菇 (Flammulina velutipes) 為表現宿主，採用農桿菌媒介法轉入外來基因。前人的研究顯示，農桿菌媒介法可使基因穩定的嵌入染色體，不易因多次繼代而被剔除，但其發展性卻受限於低表現量，因此提升蛋白質產量為首要之務。因此在本研究中，比較不同長度的金針菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glycerol dehyde-3- phosphate dehydrogenase, GPD) 啟動子對於蛋白質表現量的影響。 結果顯示當gpd啟動子分別刪除114 bp和637 bp後，可得到表現量最高的轉形株，綠螢光蛋白質 (enhanced green fluorescent protein, eGFP) 的表現量於每克總可溶蛋白質中，最高可達4.38 毫克(mg)；顯示當刪除特定片段後，可能去除啟動子上的轉錄因子結合位 (transcriptional factor binding sites)，或是造成二級結構的改變，增加基因的轉錄效率，因此大幅提升表現量。本研究亦成功以全長gpd 啟動子於金針菇中表現B型肝炎病毒所產生蛋白質的表面抗原 (Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)，但每克的總可溶蛋白質中，僅佔28.4奈克(ng)，未來亦將採用刪除特定長度的gpd啟動子，提升HBsAg在金針菇的表現量。